北京灵山野生桑黄的分离鉴定与生物学特性*

韩 鹏，孔繁帝，陈青君，张国庆，**

（1.北京农学院生物与资源环境学院 北京农学院林木分子设计育种高精尖创新中心农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2.北京农学院植物科学技术学院农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206）

桑黄，俗称桑耳、桑臣、猢狲眼等，是我国著名药用真菌，药用历史超过2 000年，早在秦汉时期《神农本草经》中已有记载[1]。中医认为，桑黄“性甘、平，味苦、辛，归肝、膀胱经”，可用于治疗血崩、脱肛泻血、脾虚泄泻等病症[2-3]。现代医学研究表明，桑黄真菌富含多糖、黄酮和三萜等活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、护肝保肝、抗氧化、抑菌消炎等作用[1，4]。分类学认为，桑黄类真菌由担子菌门 （Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes）锈革孔菌目（Hymenochaetales） 锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）中多个属真菌组成，包括纤孔菌属（Inonotus）、拟层孔菌属（Fomitopsis）、嗜蓝孢孔菌属（Fomitiporia）、木层孔菌属 (Phellinus)、桑黄属（Sanghuangporus） 等[5-6]。

鲍姆纤孔菌（Inonotus baumii）是桑黄类真菌中最常见一种药用菌，其多发生于丁香属（Syringa）植物上，尤其是暴马丁香（S.amurensis），少数生长于白蜡树属（Fraxinus）、李属（Prunus） 等植物枝干上[7]。其子实体单生，无柄，新鲜时为硬木拴质，干燥后质量变轻呈木质，初期为黄褐色后期随菌龄的增长颜色逐渐变为栗褐色至黑褐色[8]。鲍姆纤孔菌作为桑黄类真菌的主要类群，其药用活性被广泛报道，包括抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血糖、保肝、DNA损伤保护等。Zhang等[9]报道，固态发酵的鲍姆纤孔菌菌丝具有抑制白血病细胞系K562和L1210等肿瘤细胞增殖的作用。Jin等[10]报道，鲍姆纤孔菌子实体多糖具有抗氧化和DNA损伤保护功能。Sung等[11]发现，分离自鲍姆纤孔菌的β-葡聚糖具有激活NADPH氧化酶（NOC），能够增强巨噬细胞介导的吞噬作用和氮氧化物活性。Zhang等[12]从人工栽培的鲍姆纤孔菌子实体中分离获得多糖PPB-2，发现其具有降血糖和肝保护作用。

北京小龙门森林公园位于北京市门头沟区（北纬 39°58′，东经 115°26′），小龙门森林公园属小五台山脉，园内平均海拔1 150 m，年降水量为500 mm～600 mm，园内生物资源丰富，种类繁多[13]。郝德旺等[14]报道，园内共采集并鉴定出47种真菌，隶属于子囊菌门2目、2科、3种和担子菌门5目、18科、44种。通过以采集自小龙门森林公园的野生桑黄子实体为材料，分离获得纯培养菌株，进一步开展分类学鉴定、最适培养条件研究，旨在为我国野生药用真菌资源保护与利用奠定理论与实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

野生桑黄子实体样品采集自小龙门森林公园，纯培养菌株由北京农学院生物科学与工程学院分离、鉴定和保藏，菌株编号为F1637。

1.2 培养基

菌株分离与保藏使用土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基，液体发酵培养试验利用土豆葡萄糖（PD）培养基，菌丝体最适培养条件试验采用基础培养基（葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂 20 g，硫酸镁 0.5 g、维生素 B110.0 mg，pH 7.0～7.2，蒸馏水1 000 mL） 和加富培养基（葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、马铃薯200 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁 0.5 g、维生素 B1 10.0 mg，蒸馏水 1 000 mL）[15]。

1.3 菌株分离、培养与保存

菌株纯培养分离以子实体为材料，采用组织分离法，28℃ 培养，4℃ 保存[16]。

1.4 形态鉴定

观察子实体形态特征并记录。采用插片法进行菌丝体形态观察，在无菌条件下，将直径为5 mm的纯培养F1637菌丝接种于PDA平板中央，在距离接种点1.5 cm左右的培养基上，以30°～45°斜插入无菌的盖玻片，28℃避光培养。待菌丝体生长蔓上载玻片后，取出载玻片进行菌丝体显微观察并拍照[16]。

1.5 分子鉴定

分别采用内转录间隔区（ITS）和核糖体大亚基基因（LSU-rDNA） 鉴定，引物序列见表1。F1637菌株的菌丝体总DNA提取使用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）。PCR产物测序，利用BLAST在线比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）分析，利用MEGA 7.0软件、以Neighbor-joining法构建系统进化树，分析同源关系。

1.6 菌丝体最适培养条件

开展F1637菌株菌丝体最适培养条件研究，依次进行最适碳源、最适氮源、最适碳氮比、最适生长因子、最适温度和最适pH试验，每个试验组设3个平行。以直径5 mm的新鲜菌饼接种于各试验组平板中央，除最适温度试验外，各平板于28℃避光培养，待任意处理长至平板3/4或培养14 d后停止培养，观察并记录菌落特征，测量菌落直径，计算菌丝体日均生长速率。菌丝生长速率（V，mm·d-1）的计算公式为[15]：

式中：S为菌落半径（mm）；D为菌丝生长天数（d）。

1.7 发酵培养与发酵液收集

液体发酵采用PD培养基，500 mL锥形瓶装液150 mL，接种5个直径为5 mm菌饼、28℃、150 r·min-1培养20 d，以8层纱布过滤菌丝体，收集滤液，4℃、12 000 r·min-1离心5 min，收集上清液备用。

1.8 发酵液中多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定发酵液中总糖含量[19-20]，采用3，5-二硝基水杨酸法测定发酵液中还原糖含量[21-22]。发酵液中多糖含量（mp，g·L-1）计算公式为[23]：

式中：mp、mc和mr分别每升发酵液中多糖、总糖和还原糖的含量（g·L-1）。

1.9 统计学分析

所有数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定

F1637菌株子实体、菌落及菌丝体形态见图1。

如图1A所示，菌株子实体蹄型，无柄，坚硬木栓质，长3.5 cm，宽2.8 cm；菌盖呈黑灰色，有放射状开裂。纯培养菌落形态如图1B所示，菌丝初期为白色绒毛状，后逐渐变为浅黄至黄褐色，边缘为白色细微菌丝；菌丝在PDA平板上生长较缓慢，28℃培养4 d～6 d直径约3 cm左右，14 d长满平板。F1637菌株菌丝显微形态如图1C所示，菌丝有分枝和分隔，无锁状联合。

2.2 分子鉴定

经PCR扩增和测序，获得F1637菌株ITS以及LSU-rDNA序列片段，长度分别为752 bp和619 bp，利用BLAST在线比对，以纤孔菌属相近种，利用MEGA 7.0软件构建系统发育树见图2、图3。

由图2、图3系统发育分析表明，F1637菌株与鲍姆纤孔菌（I.baumii）相似性最高，为98%；ITS遗传距离为 0.017 0，LSU-rDNA 遗传距离为 0.004 0，结合形态学特征，确定该菌株为鲍姆纤孔菌。

2.3 最适碳源

不同碳源对F1637菌株菌丝体生长的影响见表2。

由表2所示，F1637菌株在不同碳源培养基上均能生长，生长速率由快到慢依次为：山梨醇＞葡萄糖≈甘露醇≈蔗糖＞淀粉＞麦芽糖≈对照＞乳糖≈羧甲基纤维素钠。菌丝在以山梨醇为碳源的培养基上生长最佳，菌落浅黄色、产生褐色色素，中央菌丝（接种点附近）白色、外周浅黄色；其次为葡萄糖及甘露醇培养基，葡萄糖培养基上菌落黄色、产生褐色色素，中央菌丝黄色、外围菌丝浅黄色，甘露醇培养基上菌落黄色；在以蔗糖、淀粉、麦芽糖为碳源的培养基中，菌丝生长速率较慢且菌丝稀疏；在以乳糖为碳源的培养基中菌丝长速慢但较浓密；以羧甲基纤维素钠为碳源的培养基中，菌丝生长慢且稀松；而在空白对照培养中，菌丝稀疏。综合菌丝长势和生长速率，该菌株最适碳源为山梨醇，其次为葡萄糖或甘露醇。

表2 碳源对F1637菌株菌丝体生长的影响Tab.2 Effect of the carbon sources on mycelial growth of strain F1637

2.4 最适氮源

不同氮源对菌株F1637菌丝体生长的影响见表3。

表3 氮源对F1637菌株菌丝体生长的影响Tab.3 Effect of the nitrogen sources on mycelial growth of stain F1637

由表3可知，在空白对照组、玉米粉和黄豆粉氮源培养基上，F1637菌株均无法生长；其他培养基菌株F1637菌丝均能生长，生长速率由快到慢依次为：酵母浸粉＞胰蛋白胨＞牛肉浸膏＞硫酸铵＞尿素≈硝酸铵＞甘氨酸。在不同氮源培养基上，菌落颜色表现出由浅黄到黄褐色的不同颜色，并产生浅褐至深褐色色素。菌株在以酵母浸粉为氮源的培养基上菌丝生长最佳，菌丝生长速率快且浓密，产生浅褐色色素；其次为胰蛋白胨，菌丝形态与酵母浸粉相比略稀松；空白对照组、玉米粉、黄豆粉培养基在接种点处产生褐色色素，但无显著菌丝生长。结合菌丝生长速率与长势，该菌株的最适氮源为酵母浸粉。

2.5 最适碳氮比

碳氮比对菌株菌丝生长的影响见图4。

由图4可知，F1637菌株在碳氮比在10∶1～60∶1条件下下均能生长，生长速率由快到慢依次为：50∶1＞60∶1＞30∶1＞40∶1＞20∶1＞10∶1。F1637菌株在各碳氮比条件下均产生褐色色素，菌丝在10∶1培养基上呈淡黄色，随着碳氮比的增加颜色逐渐加深，碳氮比50∶1和60∶1时为灰褐色。菌株在碳氮比为50∶1时的培养基中生长最快，但菌丝略呈绒毛状且较为稀疏，有褐色色圈产生；菌株在碳氮比为60∶1的培养基上生长稍慢于50∶1，但菌丝生长较为致密且长势旺盛，为淡黄色。综合菌丝长势和长速，该菌株的最适碳氮比为60∶1。

2.6 最适生长因子

不同生长因子对F1637菌株菌丝体生长影响见表4。

表4 生长因子对F1637菌株菌丝体生长的影响Tab.4 Effect of growth factor on mycelial growth of strain F1637

由表4可知，F1637菌株在不同生长因子培养基上均能生长，且均产生浅褐色至褐色色素圈，生长速率由快到慢依次为：维生素B6≈维生素B1≈对照＞维生C≈肌醇≈维生B2。在维生素B6的培养基中，菌丝长势优于其他试验组，综合菌丝生长速度和长势，认为该菌株的最适生长因子为维生素B6。

2.7 最适温度

不同温度对F1637菌株菌丝体生长影响见图5。

有图5可知，该菌株在各温度条件下均能生长，生长速率由快到慢依次为：32℃＞30℃≈28℃＞26℃＞24℃≈37℃＞20℃。该菌株在不同温度培养时均产生褐色色素；26℃～37℃菌丝生长速率较快，且较浓密，温度过高或过低时，菌丝生长速率较慢。综合生长速率和长势，最适合该菌株生长的温度为32℃。

2.8 最适pH

不同pH对F1637菌株菌丝体生长影响见图6。

由图6可知，该菌株在pH 4～9条件下均能生长，在中性偏酸环境中长势最好，生长速率由快到慢依次为：pH 6≈pH 7＞pH 5≈pH 8＞pH 9≈pH 4。F1637菌株在pH为6时生长最快，产生产黄色色素。pH为5和7时，菌丝长势良好，均产生褐色色素，但pH 5条件下菌丝成散射状辐射。在pH为4时，菌丝较浓密，产生黄色色素。pH为8和9时，菌丝生长较稀疏，均产生褐色色素。综合菌丝生长速率和长势，该菌株生长的最适pH为6。

2.9 发酵液生物活性测定

F1637菌株经液体发酵培养20 d后，发酵液还原糖、总糖及多糖测定结果表明，发酵液还原糖含量为 3.68 g·L-1、总糖含量为 16.69 g·L-1、多糖含量为 13.01 g·L-1。

3 讨论

桑黄是一种名贵中药，在我国有着上千年的药用历史，其主要药用部分为子实体。以采集自北京小龙门国家森林公园的一株野生桑黄子实体为材料，获得纯培养菌株，编号为F1637。该菌株新鲜菌丝呈白色，成熟菌丝呈黄褐色，有隔、有分支、无分生孢子，未见锁状联合，与戴玉成[8]对鲍姆纤孔菌报道基本一致。分别利用ITS与LSU-rDNA序列的分子鉴定结果表明，F1637菌株与鲍姆纤孔菌亲缘关系最近，相似度为98%。结合形态与分子鉴定结果，确定该菌株为鲍姆纤孔菌。

由于野生桑黄资源有限，开展菌丝培养和发酵培养，是桑黄开发利用的必然途径。F1637菌株菌丝体生长的最适碳源为山梨醇、最适氮源为酵母浸粉、最适碳氮比比为60∶1，最适生长因子为维生素B6、最适温度32℃、最适pH为6。刘春静等[24]报道，鲍姆纤孔菌菌丝生长的最适碳源为甘露醇和葡萄糖，最适氮源为蛋白胨，最适pH为6～8；刘红锦等[25]报道，鲍姆纤孔菌菌丝生长的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨，最适温度为28℃，最适pH为6，在光照条件下比连续黑暗条件下生长更快。F1637菌株菌丝最适培养条件与前人报道接近，但有更高的最适温度，表明该菌株为高温型菌株。

多糖是桑黄的主要功能活性成分，包括子实体多糖、菌丝体多糖和胞外多糖[2，4]。F1637菌株以PD培养基发酵培养20 d，发酵液中粗多糖含量为13.01 g·L-1。牛广财等[26]报道，裂蹄纤孔菌（Inonotus linteus） 以糙米粉、豆饼粉、KH2PO4、VB2培养基、26℃、170 r·min-1振荡培养7 d，胞外多糖产量可达3.09 g·L-1。郭霞等[27]报道，裂蹄纤孔菌以蔗糖、玉米浆、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、VB1为培养基、7 L发酵罐发酵培养，胞外多糖在120 h达最大（3.28 g·L-1）。液体发酵后期，随着营养物质的消耗，菌丝会自溶而释放出菌丝体多糖。试验中F1637菌株发酵时间较长，有利于获得更多的胞外多糖和菌丝体多糖。