碳氮源对广叶绣球菌液体发酵的影响*

马 璐 ，杨 驰 ，肖冬来 ，江晓凌 ，应正河 ，林衍铨 **

（1.福建省农业科学院食用菌研究所，福建 福州 350014；2.特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350014）

广叶绣球菌（Sparassis latifolia） 又名绣球菌、绣球菇、花瓣茸，隶属担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲 （Agaricomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 绣球菌科（Sparassidacea） 绣球菌属（Sparassis），是一种药食同源的大型真菌，近年来已成功实现工厂化栽培。绣球菌味道鲜美、营养丰富、富含多种生物活性物质，现代医学研究证实，绣球菌中的β-葡聚糖具有抗肿瘤[1]、调节免疫[2]等多种功效，可促进链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的伤口愈合[3]，提高环磷酰胺所致骨髓造血功能受到抑制小鼠的造血功能[4]。因此，绣球菌是一种药食同源的健康保健食品。

食用菌菌种按形态特征可分为固体菌种和液体菌种，与传统的固体菌种相比，液体菌种具有培养菌种菌龄一致、制备周期短、便于机械化接种等诸多优势[5]，已逐渐成为食用菌工厂化栽培菌种制备的发展方向。据统计，全国金针菇（Flammulina velu－tipes）产量前十位的企业均采用液体菌种，杏鲍菇（Pleurotus eryngii）固体菌种正在被逐渐替代，真姬菇（Hypsizygus marmoreus） 液体菌种也处于探索过程[6]，平菇 （Pleurotus ostreatus）、香菇 （Lentinus edodes）、黑木耳 （Auricularia auricula） 等液体菌种生产技术也在迅猛发展[5]。

碳源与氮源是绣球菌菌丝生长过程中的重要营养物质，为了制备出优良的液体菌种，首先要对液体发酵培养基配方进行筛选。绣球菌液体培养的适宜碳源有葡萄糖[7]、麦芽糖[8]、可溶性淀粉[9]、玉米淀粉[10]、啤酒酵母、蜂蜜粉[11]等；最适氮源以牛肉浸膏[8]、蛋白胨[7]为主。目前关于绣球菌液体发酵的研究较多，但多数以提高次生代谢产物[8,12]或菌丝体生物量[7,10-11]为最终目的，真正作为液体菌种应用于大规模生产的研究却鲜有报道。前期试验结果表明，葡萄糖、鱼粉蛋白胨可作为绣球菌液体培养的适宜碳源及氮源[13]，由于液体发酵过程中，当培养基碳氮比保持不变时，培养基中碳源与氮源的添加量可有较大变化。因此，液体发酵培养基应同时兼顾二者的比例及实际用量。

本试验在前期研究结果基础上，结合菌球形态特征，研究培养基中碳氮源比例及实际用量对绣球菌液体发酵的影响，以期为绣球菌液体菌种应用于工厂化栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

广叶绣球菌 （S.latifolia）（闽认菌 2013005），由福建省农业科学院食用菌研究所提供。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基（PDPA）：马铃薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、鱼粉蛋白胨 2 g·L-1、琼脂粉16 g·L-1，pH自然。液体种子培养基：马铃薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、2 g·L-1鱼粉蛋白胨，pH自然。碳氮比试验基础培养基：KH2PO40.30 g·L-1、MgSO40.15 g·L-1，pH 自然。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

绣球菌接种于PDPA培养皿上，24℃～25℃避光倒置培养20 d。

1.3.2 液体种子培养

从活化菌落边缘挑取直径7 mm菌块接种于液体种子培养基中（250 mL三角瓶，装液量100 mL），24℃～25℃，150 r·min-1避光培养10 d获得液体种子。

1.3.3 液体培养条件

采用250 mL三角瓶，装液量100 mL，灭菌后按8%（体积比）接种量接种液体种子培养基，24℃～25℃，避光，150 r·min-1振荡培养 15 d。

1.4 试验设计

根据前期试验结果[13]，以葡萄糖、鱼粉蛋白胨为液体发酵的碳源、氮源，在基础培养基中分别加入不同配比葡萄糖与鱼粉蛋白胨，观察绣球菌液体发酵效果，各处理重复3次，具体方案见表1。

表1 试验因素及水平Tab.1 Independent variable and their corresponding levels

1.5 检测数据

培养结束后，采用pH计测定培养基pH。使用移液枪，从发酵液中随机吸取一定体积培养基，测定菌球个数；另将培养基中菌球排列成直线，测其总长度后获得菌球直径平均值。后用纱布过滤发酵液，将过滤后的菌球用清水充分冲洗，40℃烘干至恒重，电子天平称重测定菌丝生物量（W，%）。

式中：M为烘干的菌丝生物量（g）；m为培养基中碳氮源的质量（g）。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用 DPS（data processing system，Version7.05） 数据处理系统进行分析。

2 结果与分析

2.1 添加不同碳源、氮源对绣球菌液体发酵效果的影响

添加不同碳源、氮源液体发酵对绣球菌培养基pH、菌球直径及菌球密度的数据统计见图1。

图1所示，不同碳氮源组合中，液体发酵结束时，培养基终点pH在3.2～4.1之间，当保持碳氮源添加比例一定时，随着二者用量的增大，培养基发酵终点pH逐渐升高，菌球直径逐渐减小。当碳氮源添加比例为30:1时，菌球密度先升高后降低，最高为14.78个/mL。绣球菌液体培养效果见图2。

由图2所示，供试范围内，菌球直径、菌球密度相差不大。当碳氮源添加比例为10:1或50:1时，供试范围内随着二者添加量增大，菌球密度逐渐增大，最高分别为 11.0个/mL、12.2个/mL，但无显著性差异。

2.2 不同碳氮源添加量对菌丝体生物量的影响

不同碳源、氮源比例下菌丝生物量见图3。

由图3所示，当葡萄糖和鱼粉蛋白胨添加比例为 10∶1、二者实际用量在 3∶0.3～9∶0.9 之间时，随着二者添加量的增大，菌丝体生物量逐渐升高，最高（3.56±0.32） g·L-1，达到显著性差异，随后菌丝体生物量逐渐减小。葡萄糖和鱼粉蛋白胨添加比例为30∶1时也有类似趋势，菌丝体生物量最高为（2.76±0.25） g·L-1。当葡萄糖和鱼粉蛋白胨添加比例为50∶1、二者实际用量为分别为12%和0.24%时，菌丝体生物量达到最大值 （2.23± 0.15） g·L-1，此后菌丝体生物量虽有减小，但与最大值无显著性差异。鱼粉蛋白胨添加量对绣球菌液体培养的影响见图4。

由图4可知，葡萄糖添加量在3%～9%之间、且葡萄糖添加量一定时，随着鱼粉蛋白胨用量的增大，菌丝体生物量逐渐升高，达到显著性差异。葡萄糖用量在12%～15%之间，随着鱼粉蛋白胨用量的增大，菌丝体生物量呈增大趋势，但无显著性差异。不同碳氮源组合下菌丝体生物量得率见图5。

由图5可知，在供试范围内，当葡萄糖用量一定时，随着碳氮比值的降低，菌丝体生物量得率逐渐升高，当葡萄糖用量3%，鱼粉蛋白胨用量0.3%时，菌丝生物量得率最高为8.6%。随着葡萄糖用量的增大，菌丝体生物量得率逐渐下降且趋于稳定。

3 讨论

液体发酵培养基可提供菌丝生长所需的各种营养物质，且适宜的营养比例可促进菌丝生长及次生代谢产物的积累。阿魏菇（Pleurotus ferulae） 液体发酵培养基碳氮比为20∶1时，菌球直径、菌球密度与菌丝球个数均达到最大[14]；桑黄（Phellinus igniarius） 液体发酵碳氮比为20∶1～25∶1，菌球数量多且均匀，但对胞外多糖产量影响不明显[15]，而适宜桑黄多酚、黄酮和甾醇的碳氮比为80∶1[16]。

绣球菌液体发酵时，当葡萄糖浓度较低时（3%～9%），随着鱼粉蛋白胨用量增大，菌丝生物量逐渐升高，且达到显著性差异，表明在一定范围内可通过调节培养基碳氮比来促进菌丝生长；前期研究结果也已证实，通过增加培养基中鱼粉蛋白胨含量来调节碳氮比，可促进菌丝生物量的提高[13]；这也表明，培养基适宜的碳氮比可促进菌丝生长。当葡萄糖用量继续增大时（12%～15%），虽然仍可通过增加培养基中鱼粉蛋白胨用量来调节至适宜的碳氮比，但菌丝生物量增大趋势已趋于缓慢，无显著性差异，且单位营养物质下菌丝体生物量得率也呈现类似趋势。这也进一步说明，在提及培养基的碳氮比时，应同时考虑二者的实际使用量。

液体发酵过程中，为了达到最大菌丝生物量，可适当增加营养物质含量，但营养物质用量过量将导致培养基黏度及渗透压增大，最终影响菌球形态特征。试验结果中，保持培养基中碳氮源添加比例一定时，按比例增加二者实际使用量，菌球直径逐渐减小，达到显著性差异，菌球密度也有增大趋势，与阿魏菇的液体发酵过程类似[14]。因此，综合考虑培养基成本及发酵效果，适宜绣球菌液体发酵的葡萄糖用量为3%，鱼粉蛋白胨用量0.3%。

液体菌种培养过程中，除碳氮源之外，培养基pH、微量元素及生长因子、消泡剂等均会影响液体发酵效果，即使采用相同的培养基，发酵工艺不同时菌球活力也有差异。因此，在后续研究中，可进一步对上述因素进行探讨，为研发出高活力的绣球菌液体菌种提供参考。