地耳菜乙醇提取物的生物活性

沙金，陈烽，李超，汤薇，魏逸超，陈盛芳

徐州工程学院食品与生物工程学院（徐州 221018）

地耳菜（Nostoc sphaeroids）又名葛仙米，为我国常见的传统食用藻类之一。地耳菜的活性成分主要为多糖、蛋白质及多酚等[1]，在提高免疫力[2]、抗氧化[3]及抗炎[4]等方面具有较好的效果。试验从地耳菜乙醇提取物的成分分析、抗氧化活性、抑制胰脂肪酶、乙酰胆碱酯酶及HepG2细胞增殖活性等多个方面进行研究，为地耳菜的开发利用提供论据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

地耳菜（宁夏香草生物技术有限公司）；没食子酸标准品（中国药品生物制品检定所）；芦丁标准品（上海如吉生物科技有限公司）；对二甲氨基肉桂醛（p-DMACA，上海源叶生物科技有限公司）；Ferrozine、L-抗坏血酸、4-硝基苯棕榈酸酯（pNPP）、胰脂肪酶和乙酰胆碱酯酶（合肥博美生物科技有限公司）；Orlistat（北京泛球生物科技有限公司）；二硫代硝基苯甲酸（DTNB，上海伊卡生物技术有限公司）；碘化硫代乙酰胆碱（AChI，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；胰酶细胞消化液（上海碧云天生物技术有限公司）；四甲基噻唑蓝（MTT）、2, 2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）（美国Sigma-Aldrich公司）；人肝癌细胞HepG2（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培养基、DMEM培养基、青链霉素混合液（美国Thermo Fisher Scientific公司）；其他试剂为分析纯。

1.2 设备与仪器

LGJ-10型真空冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）；JHBE-50T型闪式提取仪（成都宜邦科析仪器有限公司）；723C型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy H1型全功能酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 乙醇提取物的制备

原料→烘干（60 ℃）→粉碎→过筛（0.150 mm）→浸泡（70%乙醇，液料比10∶1 mL/g，12 h）→闪式提取（电压80 V，每次60 s，3次）→离心（4 000 r/min，15 min）→抽滤→减压浓缩→冷冻干燥→乙醇提取物

1.3.2 成分含量的测定

1.3.2.1 多酚含量测定

采用福林酚法[5]。

1.3.2.2 黄酮含量测定

采用NaNO2-Al3+-NaOH法[6]。

1.3.3 抗氧化活性测定

1.3.3.1 总还原力

按参考文献[7]方法稍有修改。将0.5 mL不同质量浓度的地耳菜乙醇提取物溶液、1.25 mL 0.2 mol/L的PBS缓冲液（pH 6.6）和1.25 mL 1%铁氰化钾溶液混合，晃匀，50 ℃避光反应20 min后，加入1.25 mL 10%三氯乙酸终止反应进行，并对溶液进行离心；将4.25 mL纯净水和0.85 mL 0.1% FeCl3溶液加入离心后的上清液，摇匀，测定700 nm处溶液的吸光度，记作As；同时设不含试样的空白组，测定吸光度，记作At。

1.3.3.2 DPPH自由基清除

按参考文献[8]方法稍有修改。在3 mL 2.05×10-4mol/L DPPH溶液中加入1 mL不同质量浓度的地耳菜乙醇提取物溶液，晃匀，37 ℃避光反应1 h。测定溶液517 nm处吸光度，记作Am；采用纯净水替代试样溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作An；同时设不含DPPH的空白组，重复上述过程，测定吸光度，记作Ak。

1.3.3.3 亚铁离子螯合

按参考文献[9]方法稍有修改。将1.0 mL不同质量浓度的地耳菜乙醇提取物溶液、2.73 mL纯净水和70 μL 2 mmol/L硫酸亚铁溶液依次加入到试管，晃匀，加入200 μL 5 mmol/L Ferrozine溶液促使螯合反应开始，37 ℃避光保温20 min，测定562 nm处溶液吸光度，记作Ao；测定不含试样时溶液的吸光度，记作Ap；采用纯净水代替硫酸亚铁溶液和Ferrozine溶液，测定吸光度，记作Aq。

1.3.4 抑制胰脂肪酶活性测定

按参考文献[10]方法稍有修改。在96孔板中依次添加50 μL不同质量浓度的地耳菜乙醇提取物溶液与50 μL 1.2 U/mL胰脂肪酶溶液，37 ℃避光保温10 min；加入100 μL 0.2 mmol/LpNPP溶液，晃匀后于37 ℃避光反应20 min，测定溶液在405 nm处吸光度，记作Ai；采用PBS代替试样溶液，测定吸光度，记作Ac；采用PBS代替胰脂肪酶溶液，测定吸光度，记作Aj；采用PBS代替试样和胰脂肪酶溶液，测定吸光度，记作Ad。

1.3.5 抑制乙酰胆碱酯酶活性测定

按参考文献[11]方法稍有修改。在4 mL离心管中依次添加500 μL不同质量浓度的地耳菜乙醇提取物溶液与50 μL 0.16 U/mL乙酰胆碱酯酶（AChE）溶液；混匀，37 ℃避光反应15 min；加入200 μL 1 mmol/L DTNB溶液和200 μL 1.875 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱溶液；混匀，37 ℃避光反应20 min；405 nm处测定吸光度，记作Ai；采用PBS代替试样溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Ac；分别用PBS代替乙酰胆碱酯酶溶液、试样溶液、试样和乙酰胆碱酯酶溶液，并测定其吸光度。抑制率计算参考1.3.4。

1.3.6 抑制HepG2肝癌细胞增殖活性测定

按参考文献[12]方法稍有修改。取经过消化处理的对数期细胞，并用培养基配制细胞悬液（1×105个/mL），转移100 μL至96孔板中37 ℃培养1 d，除去每孔中原有培养基，将配制好的不同质量浓度梯度的地耳菜乙醇提取物溶液加入每孔中，继续37 ℃培养1 d后，加入MTT，37 ℃培养4 h结束培养周期，加入DMSO使每孔中的沉淀物质充分溶解后，490 nm处酶标仪测定吸光度，并测定只含RPMI-1640培养基的空白组和不含地耳菜乙醇提取物溶液的对照组的吸光度。

1.3.7 数据分析

所有数据采用均数±标准差表示，IC50值采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及多酚黄酮测定结果

2.1.1 标准曲线

多酚回归方程为y=0.082 4x-0.002 2（R2=0.996 8），结果表明多酚测定在0～9 μg/mL之间线性良好；黄酮回归方程为y=0.010 9x-0.009 2（R2=0.999 0），结果表明，黄酮测定在0～72 μg/mL之间线性良好。

2.1.2 测定结果

地耳菜乙醇提取物中多酚含量10.22±0.06 mg GAE/g FDW，黄酮含量41.37±0.30 mg RE/g FDW。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 总还原力

以VC为代表的部分抗氧化剂，可以通过其自有还原性与氧化剂反应，从而避免其他物质被氧化，故总还原力是常用的评价试样抗氧化活性的方法之一。由图1可知，地耳菜乙醇提取物有较好的还原力，其在质量浓度15～150 μg/mL范围内，Arp的变化为0.045～0.641，且与地耳菜乙醇提取物的质量浓度呈正相关。Arp相同时，VC质量浓度远低于地耳菜乙醇提取物的质量浓度，说明VC的还原力更好。

图1 总还原力

2.2.2 DPPH自由基清除

抗氧化剂可以与DPPH分子中的1个自由基上的自由电子配对，从而减少自由基的数量，常用于评估试样的抗氧化能力。由图2可知，在质量浓度50～500 μg/mL范围，地耳菜乙醇提取物对DPPH清除率为1.68%～88.25%，且清除率与试样质量浓度呈正比，IC50值为217.25 μg/mL，而VC的IC50值为2.41 μg/mL，说明VC对DPPH自由基的清除能力更强。

2.2.3 亚铁离子螯合

金属离子不仅具有氧化性，而且是氧自由基产生过程中必需物质，而螯合剂能与金属离子结合生成稳定的化合物，降低其对氧化过程的作用，故螯合性常用于评价试样抗氧化能力。由图3可知，在质量浓度90～900 μg/mL范围内，地耳菜乙醇提取物质量浓度逐渐增加时，其对亚铁离子的螯合能力也同步升高，且最大螯合率为88.45%。地耳菜乙醇提取物对亚铁离子螯合的IC50值为320.31 μg/mL，EDTA-2Na的IC50值为4.63 μg/mL，说明EDTA-2Na的抗氧化能力强于地耳菜乙醇提取物。

图2 DPPH自由基清除活性

图3 亚铁离子螯合活性

2.3 抑制胰脂肪酶活性分析

胰脂肪酶活性过高时，会使血液中的脂质含量升高，从而导致血脂异常；抑制胰脂肪酶的活性，可以减少脂质的分解，从而降低人体对脂质的吸收。由图4可知，质量浓度12.5～100 μg/mL内，地耳菜乙醇提取物对胰脂肪酶活性的抑制率为10.7%～62.89%，且抑制率与地耳菜乙醇提取物的质量浓度呈正相关。地耳菜乙醇提取物的IC50值为74.81 μg/mL，阳性对照Orlistat的IC50值为0.16 mg/mL，说明Orlistat对降血脂的效果更好。

图4 抑制胰脂肪酶活性

2.4 抑制乙酰胆碱酯酶活性分析

乙酰胆碱酯酶能迅速水解作用于突触后膜的神经递质，保证神经信号的正常传递；其活性过高使得突触间的神经递质过早被水解，被认为是导致阿尔茨海默病的原因之一。由图5可知，在质量浓度0.5～4.0 mg/mL范围内，地耳菜乙醇提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率为19.69%～67.76%，且抑制率与地耳菜乙醇提取物的质量浓度呈正相关。地耳菜乙醇提取物的IC50值为2.47 mg/mL，阳性对照Galantamine的IC50值为0.016 μg/mL，说明Galantamine对改善阿尔茨海默病的效果更好。

图5 抑制乙酰胆碱酯酶活性分析

2.5 抑制HepG2细胞增殖活性分析

HepG2是一种常见且稳定的人肝癌细胞，国内外学者常用其进行肝癌发病机理的探究和治疗肝癌药物的筛选。由图6可知，在质量浓度450和900 μg/mL范围内，地耳菜乙醇提取物对HepG2肝癌细胞增殖的抑制效果远低于75 μg/mL的阳性对照5-FU对应的抑制率，说明其抑制HepG2肝癌细胞增殖的活性较差。

图6 抑制HepG2细胞增殖

3 结论

试验测定地耳菜乙醇提取物中多酚和黄酮含量，并评价其抗氧化、降低血脂及抑制乙酰胆碱酯酶活性的效果，同时探究其作为抗肿瘤药物的可能性，为地耳菜生物活性的开发利用提供理论依据。结果表明，地耳菜乙醇提取物具有较好的还原力，能有效清除DPPH自由基并较好地螯合亚铁离子；在活性抑制方面，地耳菜乙醇提取物能有效地抑制胰脂肪酶活性，但其对乙酰胆碱酯酶及HepG2细胞增殖活性的抑制效果并不明显。因此，地耳菜乙醇提取物可作为制备天然抗氧化剂及降血脂药物的原料，具有广阔的开发利用空间和巨大市场潜力。