清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤Nestin、NGF表达的影响

俞睿 祝美珍 刘倩菁 向昱臻 苏萍 韦亮 孙诗杰

(广西中医药大学，广西 南宁 530200)

缺血性脑血管疾病作为临床常见病和多发病，其发病年龄逐渐呈现年轻化趋势，已成为威胁人类健康与生命的重要疾病之一。目前临床上主要采用溶栓、降纤和神经保护等治疗手段，但受制于其严格的时间窗和适应、禁忌证要求，预后效果并不理想。如何有效提高缺血性脑血管疾病治疗效果、改善患者遗留的后遗症是医学界长期研究的重点和热点。近年来研究发现，脑缺血损伤可诱导内源性神经干细胞的增殖，巢蛋白 (Nestin) 作为神经干细胞(NSC)的标记物，已广泛应用于NSC的鉴定，其在脑组织损伤中的表达规律与NSC增殖及凋亡存在密切关联性〔1〕。而神经生长因子(NGF) 作为神经营养因子家族(NTF) 中重要的细胞因子，在脑缺血损伤后，对神经元起到修复作用，可改善神经元的病理状态。已有研究证实〔2，3〕，通过增加脑缺血损伤中的Nestin、NGF蛋白表达水平，能有效可促进神经元的再生，抑制神经细胞凋亡。近年来由于中药复方多靶点、多途径的优势与特点在预防和治疗缺血性脑血管疾病方面取得了显著成效。根据“祛瘀生新，精成髓生”理论而谴药组方的清脑益元汤，经前期临床和实验研究发现有较好的治疗效果。因此，本研究基于前期研究基础上通过观察清脑益元汤对脑缺血损伤性大鼠Nestin、NGF表达水平的影响，试图进一步探明清脑益元汤防治缺血性脑血管病的作用机制，为清脑益元汤防治脑缺血损伤提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1实验动物 成年健康SPF级雄性SD大鼠192只，体重(250±50)g，均购自广西医科大学动物实验中心(实验动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002，实验动物使用许可证号：SYXK桂2014-0003)。饲养于广西中医药大学动物实验中心，常规自由饮食饮水饲养。

1.2实验药物 清脑益元汤：水牛角30 g、水蛭8 g、肉苁蓉10 g、赤芍15 g、参三七10 g、川牛膝15 g、紫河车15 g、红景天20 g、干地黄10 g、制首乌10 g，以上所用药材均由广西中医药大学第一附属医院购入。

1.3实验设备与试剂 手动轮转石蜡切片机(德国Leica公司)、-80℃超低温冰箱(海尔公司)、蔡司显微镜(德国Zeiss公司)、高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、全自动实时荧光定量PCR仪(LightCycler96)、Nestin单克隆抗体(英国abcam公司，生产批号：GR3234309-2)、NGF单克隆抗体(英国abcam公司，生产批号：GR226375-44)、反转录试剂盒(北京天根生物科技有限公司，生产批号：R6424)、扩增试剂盒(北京天根生物科技有限公司，生产批号：R6306)、Nestin、NGF引物及内参 (上海生工股份有限公司提供) 。

1.4方法

1.4.1动物分组 将192只成年健康雄性SD大鼠按体重依次编号，用随机数字表将大鼠分为两大组，每大组再分为四小组即空白组(6只)、假手术组(30只)、模型组(30只)、清脑益元组(30只)。除空白组外，假手术组、模型组和清脑益元汤组分别按术后取材时间点分为1 d、3 d、7 d、14 d、28 d 5个亚组，5个亚组每组6只。

1.4.2动物造模 适应性喂养1 w后进行实验，空白组正常喂养，假手术组线栓插入大鼠右侧颈总动脉(0.8±0.2)cm，此深度不足以阻断大脑中动脉血流，模型组及清脑益元汤组参考Longa等〔4〕法制备大鼠大脑中动脉梗死模型(MCAO)，制成大鼠急性脑缺血损伤模型。

1.4.3给药 参照贺氏剂量-体表面积换算法〔5〕，以体重60 kg成人每天服用清脑益元汤，参考文献〔6〕中的标准方程进行换算，按体量14 ml/kg进行灌胃，为达到血药浓度，预灌药7 d，分别于每日上午9∶00～10∶00及下午16∶00～17∶00时进行灌胃，空白组、假手术组、模型组予蒸馏水灌胃，清脑益元组予清脑益元汤灌胃，药物浓度含生药材2 g/ml，直至按各时间点取材。

1.5标本采集及处理 用10%水合氯醛按35 mg/kg经腹腔注射麻醉鼠后，固定大鼠，用组织剪在大鼠胸骨下沿双侧肋骨走行方向打开胸腔，充分暴露心脏、肝脏，剪开右心耳，同时用穿刺针小心插入大鼠左心尖部并用止血钳固定，快速注入0.9%氯化钠约200 ml，灌注至大鼠全身血色变浅、变白、四肢抽搐，接着灌注4%的多聚甲醛300 ml，见肺脏、肝脏变苍白色，全身变僵硬，提示灌注成功。灌注完成后，用组织剪从颈部剪开皮肤后，用止血钳尖从脑囟门后轻微插入，咬去颅骨，充分暴露大脑后，用镊子的尾部剥取出大脑，分别放入液氮罐中(Real-Time PCR)和组织固定液中(免疫组化)。

1.6指标检测

1.6.1采用免疫组化法检测大鼠脑缺血侧皮质区Nestin、NGF表达 严格按照通用二步法试剂盒操作，用显微镜10×视野进行观察整体阳性表达情况，再取40×视野进行拍照。运用Image图像分析软件对缺血侧皮质区Nestin、NGF阳性细胞进行统计，取其平均值。

1.6.2采用Real-Time PCR法检测大鼠脑缺血侧皮质区Nestin、NGFmRNA的表达 提取总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增条件：预变性95℃、15 min；采用二步法进行扩增，变性95℃、10 s；退火/延伸60℃、32 s；共进行40个循环；选择SYBR GreenⅠ法，点击开始反应，结束后得到扩增曲线、溶解曲线和Ct值。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.7统计学方法 采用SPSS24.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1清脑益元汤对大鼠脑缺血侧皮质区Nestin表达的影响 Nestin在大鼠脑组织缺血侧皮质区阳性反应物主要位于胞质，呈棕黄色或深棕褐色。空白组、假手术组可见少量Nestin阳性细胞的表达，两组在各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在相同时间点与假手术组比较，模型组、清脑益元组Nestin的阳性细胞明显升高(P<0.01)；模型组、清脑益元组Nestin阳性细胞在缺血1 d表达开始升高，3 d后达高峰，且随脑缺血损伤时间延长其表达逐渐下降；与模型组在同一时间点相比，清脑益元组Nestin阳性细胞表达明显升高(P<0.01)。见表2，图1。

2.2清脑益元汤对大鼠脑缺血侧皮质区NGF表达的影响 NGF在大鼠脑组织缺血侧皮质区免疫阳性反应物主要位于胞质和突起内，呈棕黄色颗粒。在相同时间点各组间比较，与空白组比较，假手术组NGF阳性细胞表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组相比，模型组、清脑益元汤组NGF阳性细胞表达升高有显著差异(P<0.01)；模型组、清脑益元汤组NGF阳性细胞在缺血1、3 d开始增强，7 d达到最高峰，14 d后呈逐步降低的趋势；与模型组相比，清脑益元汤组NGF阳性细胞表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表3。

2.3Real-Time PCR检测大鼠脑缺血侧皮质区Nestin mRNA的表达 在相同时间点内，与空白组相比，假手术组大鼠脑组织缺血侧皮质区Nestin mRNA的表达量无显著差异(P>0.05)；与假手术组相比，模型组、清脑益元汤组Nestin mRNA表达量显著增加(P<0.01)；模型组、清脑益元组Nestin mRNA表达在缺血1 d表达开始升高，3 d后达高峰，且随脑缺血损伤时间延长其表达逐渐下降；与模型组相比，清脑益元汤组Nestin mRNA表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表2 各时间点Nestin阳性细胞的表达个/视野)

图1 各组缺血不同时间点Nestin阳性细胞表达结果(×40)

图2 各组缺血不同时间点NGF阳性细胞表达(×40)

表3 缺血各时间点NGF阳性细胞的表达个/视野)

表4 缺血各时间大鼠缺血侧皮质区Nestin mRNA的表达

2.4Real-Time PCR检测大鼠脑缺血侧皮质区NGF mRNA的表达 在相同时间点内，与空白组相比，假手术组大鼠脑组织缺血侧皮质区NGF mRNA的表达量无差异(P>0.05)；与假手术组相比，模型组、清脑益元汤组NGF mRNA表达量显著增加(P<0.01)；模型组、清脑益元汤组NGF阳性细胞在缺血1、3 d开始增强，7 d达到最高峰，14 d后呈逐步降低的趋势；与模型组相比，清脑益元汤组NGF mRNA表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 缺血各时点大鼠缺血侧皮质区NGF mRNA的表达

3 讨 论

3.1脑缺血损伤与Nestin及NGF的关系 Nestin是一种在胚胎NSC呈一过性表达的中间丝蛋白，具有维持神经前体细胞正常形态的功能，随着分化、增殖和迁移的神经细胞不断发育成熟，Nestin表达强度会逐渐减弱甚至消失，并逐渐被其他中间丝蛋白所代替。Nestin主要存在于胚胎发生期的中枢神经系统中，被认为是神经前体细胞或NSC的特异性标记物之一〔7〕。近年来研究发现，在脑缺血损伤早期可诱导Nestin的表达，而在脑缺血损伤最严重的区域表达最为明显。Nestin作为NSC的特异性标记蛋白，可诱导内源性NSC的增殖，并实现自我更新，在脑缺血损伤后，Nestin在对受损的脑组织结构进行修复和重塑以及在脑损伤区域高表达都预示了Nestin的激活。郭云良等〔8〕研究发现，在脑缺血灌注损伤后，Nestin在皮质区和纹状体区在1 d、7 d出现高表达，随后逐渐降低，结果提示Nestin具有促进NSC增殖的作用，并参与了损伤后脑组织的修复过程。NGF作为NTF之一，对神经元的增殖、分化、存活和功能维持起到调控作用〔9〕，在病理情况下，NGF可以促进脑缺血后NSC增殖，抑制神经元发生凋亡，从而对受损的神经元起到全面而持久的保护作用。王亚军等〔10〕通过子午流注针法对脑缺血动物模型进行干预研究发现，在脑缺血损伤后，针刺组NGF在6 h开始增高，7 d时达到最高峰，14 d后逐渐下降，但21 d时仍高于模型组，结果表明针刺可以上调脑内神经因子NGF表达，改善神经元细胞生存的微环境，促进脑缺血后NSC的增殖，减轻脑损伤，从而发挥脑保护作用。

3.2清脑益元汤对脑缺损伤Nestin及NGF的影响 缺血性脑卒中多好发于中老年人，中医认为缺血性脑卒中是各种致病因素相互作用，阻塞脉络，填塞清窍所致，其总的病机是本虚标实。“瘀、热、毒、髓”是缺血性脑卒中的重要病机，因而在对缺血性脑卒中的治疗上，要从“血瘀→瘀热→瘀毒→髓伤”这一整体病机关联着手，深入探索清脑益元汤阻断脑缺血损伤“缺血-炎症-水肿-凋亡”的连锁效应〔11〕，在清热祛瘀的同时，要补肾益元生髓，标本兼治改善脑内环境。前期我们研究发现〔12〕，清脑益元汤能够有效抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-8阳性细胞的过度表达，阻断脑缺血损伤的炎症连锁反应，使脑脉通畅而达到防治效果。此外，临床结果表明〔13〕，清脑益元汤能减轻缺血性脑卒中患者急性期神经功能缺损程度，提高临床疗效。清脑益元汤是立足于缺血性脑卒中病因病机的基本特点，深入剖析“肾”“脑”之间的关联性，根据“祛瘀生新，精成髓生”理论，扶正祛邪的治疗法则而立法处方，同时又充分体现了中医 “病在上者下取之”的整体思想。

本实验研究结果表明，清脑益元汤可能通过上调脑内神经元Nestin、NGF蛋白及mRNA表达水平，从而参与脑缺血的内源性保护机制，促进神经细胞增殖，减轻脑缺血损伤，从而发挥脑保护作用，与相关报道研究一致〔14，15〕。推测清脑益元汤在发挥脑保护的作用机制主要有两方面：(1)在脑缺血发生、发展过程中，清脑益元汤能有效及时阻止神经元细胞凋亡，从而减轻脑损伤；(2)在清脑益元汤组方中含有清热祛瘀、补肾益精之药，易能在清热解毒、活血祛瘀之时，又能起到补肾益元生髓的效果，能有效促进脑缺血损伤后神经元修复，进而促进内源性神经干细胞增殖，达到脑保护作用。