肾衰饮对CRF大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及炎症状态的影响

张亮 马晓燕 王佳虹 远方 马贤德 席瑞

(1辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2辽宁中医药大学附属医院；3沈阳药科大学)

慢性肾衰竭(CRF)是可以由原发和继发等多种原因引起的慢性肾脏疾病，导致肾单位逐渐失去功能，当健存的肾单位不足以排出体内代谢废物和毒物时，就会导致内环境失衡，引起水、电解质和酸碱平衡紊乱〔1〕。本病病程迁延，治疗周期长且易反复，西医治疗中出现诸多不良反应。已有诸多实验和临床研究表明传统中医药对于治疗CRF存在一定的优势，可以改善患者的肾脏功能，延缓CRF的进展，延长进入肾脏替代治疗的时间，并减少并发症的发生。

CRF的发病机制比较复杂，有证据表明这一过程中细胞信号通路通过多个细胞因子介导肾纤维化起了重要作用〔2〕，共同参与CRF的发生和发展。现已发现参与肾脏间质纤维化的形成机制有炎症、氧化应激反应、细胞凋亡、增殖等。其中肾脏慢性炎症是CRF进展的重要机制，而toll样受体(TLR)4在炎症发生中发挥重要作用。有研究〔3〕发现在肾组织受损的过程中，死亡的肾脏细胞释放自身细胞内的因子，刺激免疫细胞释放促炎因子，引起TLR4/MyD88信号通路被激活，促使肾脏炎症的发生，进一步证实了TLR4/髓样细胞分化因子(MyD)88/核转录因子(NF)-κB信号通路的活化在CRF的发生发展过程中起重要作用。肾衰饮是马晓燕教授长期应用于临床治疗肾衰病的常用方，并且经临床实践经验〔4〕及实验研究〔5〕证实该方药治疗CRF疗效确切。本实验从慢性炎症角度，研究肾衰饮对信号通路TLR4/MyD88/NF-κB及其下游炎症因子表达情况的影响，探讨肾衰饮干预CRF的作用机制，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选取60只雄性SD大鼠，SPF级，6周龄，体重(180±20)g，在辽宁中医药大学实验动物中心常规饲养。

1.1.2药物与试剂 肾衰饮由黄芪、太子参、菟丝子、砂仁、白术、茯苓、法半夏、白茅根、藿香、佩兰、鳖甲、丹参、莪术、水蛭、水红花子、大黄等组成。药材均购自辽宁省中医院中草药局；尿毒清颗粒(大黄、黄芪、白术、茯苓、白芍、丹参、车前草，15 g/袋，由广州康臣药业有限公司生产)；腺嘌呤(批号：1122B051，美国Amresco公司)；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号分别：C013-2、C011-2)；水合氯醛(北京Solarbio有限公司，批号：T8590)； 多聚甲醛(北京 Solarbio有限公司，批号：P8430)；苏木素-伊红(HE)染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、TLR4、MyD88、NF-κB抗体(由博士德生物工程有限公司生产)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(由北京中杉金桥生物技术有限公司生产)。

1.1.3仪器与设备 酶标仪(thermo生产，MK3型)；电泳仪(上海天能科技有限公司生产，EPS300型)；数码显微镜(德国徕卡公司生产，DM2000型)；凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司，SF4000型)。

1.2方法

1.2.1分组与造模 将60只大鼠随机分为正常组和造模组(分别为12只、48只)，正常组予0.9%NaCl溶液8 ml/(kg·d)灌胃，造模组按照参考文献里Yokozawa法〔6〕〔予腺嘌呤悬浊液200 mg/(kg·d)灌胃〕制作大鼠肾衰模型，均连续灌胃21 d。用10%水合氯醛水溶液3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，采集球后静脉血1.5～2.0 ml，化验血Scr、BUN水平。正常组取2只，造模组取6只，分别处死取肾脏组织进行HE染色，验证造膜成功。将造模成功大鼠再随机分为模型组13只、尿毒清组12只、肾衰饮组12只。

1.2.2实验干预 肾衰饮组给予肾衰饮煎剂33.3 g/(kg·d)灌胃，每毫升药液含生药量为3.36 g；尿毒清组给予尿毒清颗粒以2.25 g/(kg·d)浓度温水溶开后灌胃；模型组和正常组予0.9%Nacl溶液8 ml/(kg·d)灌胃，连续给药4 w。

1.3样本取材及检测分析

1.3.1取材 各组大鼠连续给药4 w后，测体重，予腹腔注射10%水合氯醛水溶液3.5 ml/kg以麻醉，剖腹，采集腹主动脉血液。随机选取2只大鼠肾组织用于检测病理变化；各组剩余大鼠肾脏组织中随机选取6例，左侧肾脏置于2 ml冻存管中，-80℃保存，用于Western印迹检测；右侧肾脏浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫组织化学法检测。

1.3.2HE染色 取肾脏组织常规脱水后，浸蜡、包埋，制备4 μm切片，烤片2 h后，二甲苯脱蜡两次，然后梯度乙醇水化，行HE染色，梯度乙醇及二甲苯透明，中性树胶封片，数码显微镜下观察病理改变并拍照。

1.3.3检测各组血清Scr、BUN水平 全自动生化分析仪检测各组血清Scr、BUN水平。

1.3.4ELISA检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取各组血清样本，自然融化，具体检测方法按照ELISA试剂盒中附带的说明书步骤进行。

1.3.5Western印迹法检测肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达 取各组冻存的肾脏组织，用手术刀切取100 mg肾脏组织，剪碎，置于2 ml离心管中，并加入1 ml含苯甲基磺酰氟-蛋白酶抑制剂(PMSF)的组织裂解液，高速匀浆机制备匀浆，冰面上裂解15 min，低温高速离心机14 000 r/min离心15 min，测定蛋白浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min变性。按照40 μg/孔的上样量进行垂直电泳，湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭后，一抗(1∶400)孵育PVDF膜4℃过夜，二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，洗膜后，将PVDF膜置于凝胶成像分析系统中，并滴加电化学发光(ECL)工作液，采集图像，并以凝胶成像分析系统中自带软件测定各目的蛋白条带灰度值，并以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的相对表达水平，进行统计分析。

1.3.6免疫组织化学法检测肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达 取固定好的肾脏组织，流水下充分冲洗，常规脱水、浸蜡、包埋，制备5 μm厚石蜡切片，然后二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后，滴加3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭后，滴加一抗工作液(TLR4为1∶300；MyD88为1∶300；NF-κB为1∶200)4℃孵育过夜，次日洗片后，滴加即用型二抗工作液，37℃孵育1 h，DAB显色10 min，苏木素染色液复染，1%盐酸乙醇分化后，中性树胶封片，数码显微镜下观察，随机选取5个视野，测定平均光密度值，以均数作为该例大鼠目的蛋白相对表达水平，进行统计分析。

1.3.7统计学分析 采用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1HE染色结果 正常组大鼠肾脏肾小球、肾小管、系膜结构正常，间质未见增宽，无炎性细胞浸润。模型组大鼠肾脏肾小球囊腔变大，血管球萎缩，成纤维细胞增多，小管的管壁薄厚不匀，系膜细胞增生，肾小管上皮细胞弥漫空泡变性，大部分肾小管扩张或者萎缩，基底膜增厚、断裂，可见大量炎性细胞浸润。肾衰饮组和尿毒清组大鼠肾脏系膜细胞增生减轻，成纤维细胞减少，肾小管上皮细胞空泡变性减轻，炎性细胞减少。见图1。

2.2各组血清Scr、BUN水平 与正常组比较，模型组血清Scr、BUN水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，尿毒清组和肾衰饮组血清Scr、BUN水平均明显降低(P<0.01)，尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。见表1。

2.3各组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 与正常组相比，模型组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，尿毒清组和肾衰饮组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均明显降低(P<0.01)；与尿毒清组比较，肾衰饮组血清IL-6、TNF-α表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

图1 各组肾脏组织病理形态(HE，×200)

表1 各组Scr、BUN水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

2.4Western印迹法检测各组肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平 与正常组相比，模型组肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)，尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。见图2、表2。

图2 各组肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达

2.5免疫组织化学法检测各组肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况 正常组肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达为阴性，模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白呈强阳性表达，尿毒清颗粒和肾衰饮干预后均能不同程度的减少TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达(P<0.01)。见图3～5、表3。

表2 各组大鼠肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平比较

图3 各组TLR4蛋白表达(DAB，×200)

图4 各组MyD88蛋白表达(DAB，×200)

图5 各组NF-κB蛋白表达(DAB，×200)

表3 各组肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达比较

3 讨 论

CRF与中医文献记载的“水肿”、“虚劳”、“关格”、“癃闭”、“溺毒”等疾病的病因和症状有一致和相似之处，主要病机特点为正虚邪实，正虚以脾肾亏虚为主，为发病之根本，邪实为内生毒邪，主要是湿、痰、毒、瘀互结，是疾病加重的主要原因。西医认为CRF是各种慢性肾脏病持续进展的共同结局〔7〕。CRF可因肾组织在多种因素的影响下，单核-巨噬细胞系统被激活，巨噬细胞与肾脏固有细胞及细胞外基质相互作用，产生多种炎症因子，使肾脏处于慢性炎症状态中，肾脏固有细胞被破坏，促进细胞外基质聚积。而CRF过程中氧化应激状态被激活，导致炎症细胞被大量激活、中性粒细胞炎性浸润，产生大量促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α等〔8〕，进一步诱发炎症反应。微炎症和氧化应激反应被认为是肾功能恶化的重要机制〔9〕。现代医学认为炎症反应是CRF发生的始动因素。因此，抑制炎症因子的表达，改善炎症状态，在一定程度上能够延缓肾脏纤维化的进程，延缓CRF进展。本实验采用以腺嘌呤悬液灌胃法制作CRF大鼠模型，其机制是游离的腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，当体内尿酸浓度足够大时，其结晶主要沉积在肾小管和肾间质部位，引起肾小管阻塞及上皮细胞的萎缩或消失，周围间质可见炎性细胞浸润，肉芽肿形成且逐渐出现纤维化〔10〕。本文说明经尿毒清颗粒及肾衰饮干预后大鼠炎症反应减轻，且肾衰饮的抗炎作用优于尿毒清颗粒。免疫和炎症因子在肾脏疾病的发病机制中起重要作用〔11，12〕。天然免疫细胞，如巨噬细胞和树突细胞，被认为在介导肾脏炎症和损伤方面有重要作用〔12〕。先天免疫细胞通过识别病原体相关分子模式(PAMPs,识别外来病原体，并被刺激分泌促炎细胞因子和趋化因子〔12，13〕)和损伤相关分子模式(DAMPs,识别组织损伤产生的内源性配体)而发挥作用，其中DAMPs是肾脏先天免疫细胞活化和炎症的重要诱因。TLRs表达在先天免疫细胞和肾脏固有细胞(如系膜和肾小管上皮细胞)上，并产生促炎细胞因子和趋化因子，导致肾损伤〔13，14〕。目前认为TLR2、TLR4、TLR9 被激活均可导致肾损伤。其中，TLR4被证明可表达于肾小管上皮细胞、内皮细胞等〔15，16〕。配体与TLR4结合，导致二聚和构象改变，从而导致下游信号级联反应，下游信号的激活最终导致NF-κB进入细胞核并转录促炎症靶基因，导致炎症反应。此过程需要受体蛋白的募集，包括MyD88、含衔接蛋白的TIR结构域(TIRAP)、含衔接诱导干扰素的TIR结构域(TRIF)和TRIF相关衔接分子(TRAM)。现有研究〔17〕证明，主要有两条TLR传导途径：①由MyD88衔接蛋白介导的MyD88信号通路; ②非依赖性MyD88信号通路。而依赖性MyD88途径是TLR4的下游，该途径导致促炎细胞因子的产生，并传播到下游的NF-κB，导致转录因子的激活〔18〕。有研究表明糖尿病肾病的炎症过程中先天免疫系统被激活〔19，20〕。导致糖尿病肾病肾脏不可逆性纤维化和器官衰竭的始动因素是炎症〔21〕。在糖尿病患者的肾脏中信号通路NF-κB上调是已被认可的重要的糖尿病肾病的发病机制〔22〕。本文结果说明TLR4/MyD88/NF-κB信号通路处于过度活化状态，并且参与慢性肾功能衰竭的发生发展过程，肾衰饮可以抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白的表达，并且作用与尿毒清颗粒等同。

脾肾亏虚与毒邪互结是CRF整个病变过程发生、发展的关键〔23〕。脾肾亏虚是本病发病的基础，也是产生毒邪的根源，而毒邪亦是加重病情进展恶化及迁延不愈的重要外因。马晓燕教授依据CRF的发病机制及病机演变过程，提出了“抗毒、解毒、排毒”三法相结合的治疗思想，运用扶正与祛邪兼顾，健脾与补肾同治，重在健脾以抗毒，祛湿、化瘀以解毒，标本兼顾，临证施治，总结出经验方肾衰饮。肾衰饮以黄芪、太子参、菟丝子益气健脾补肾；茯苓、白术、半夏、砂仁健运脾胃，调理升降，助肾命之气以“抗毒”；白茅根、茯苓、藿香、佩兰健脾祛湿排“湿毒”；鳖甲、丹参、莪术、水蛭、水红花子活血化瘀以解“瘀毒”；大黄通腑泻浊以“排毒”。本研究模型组大鼠升高的炎症因子可被认为中医的毒邪，即“浊毒”“瘀血”等。因此，肾衰饮“抗毒”“解毒”“排毒”的治法可以等同于改善CRF的炎症状态。在临床上尿毒清颗粒主要治疗慢性肾功能衰竭早、中期的患者，对中医辨证属脾虚湿浊症或脾虚兼血瘀症者疗效明显，诸多实验和临床研究均已证实其在治疗慢性肾病的可行性。本研究证实肾衰饮在改善CRF大鼠肾脏功能方面作用与尿毒清颗粒是一致的，但在改善炎症状态方面肾衰饮优于尿毒清颗粒。