草地贪夜蛾幼虫僵虫发生率调查及致病菌分离鉴定

程东美，洪婉雯，孙 辉，华宏伟，张子枫，徐汉虹，张志祥*

(1.仲恺农业工程学院农业与生物学院，广州 510225；2. 华南农业大学植物保护学院，广州 510642)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)，属于鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，原分布于美洲热带和亚热带地区。2019年1月13日草地贪夜蛾入侵我国云南省(杨普云等, 2019)，4月23日广东省广州市增城区发现草地贪夜蛾幼虫入侵为害(廖永林等, 2019)，截至6月4日，已经入侵了长江流域及其以南的18个省(市、自治区)，严重威胁我国农业及粮食生产(全国农业技术推广服务中心, 2019)。草地贪夜蛾各龄幼虫均可产生为害，取食玉米的叶片、穗轴、籽粒，所到之处肆虐暴食，轻则导致田块斑驳、茎叶残缺，重则毁种，严重威胁玉米生产(张丹丹等, 2019)。

药剂防治是控制草地贪夜蛾为害的主要方法(赵胜园等, 2019)，目前我国尚无防治该虫的登记农药，根据《农药管理条例》有关规定，农业农村部在专家论证的基础上，提出了25种应急使用的农药产品，推荐给农民使用。25个产品中有17个单剂和9个以甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、高效氯氟氰菊酯为主要成分的二元混配制剂，单剂含11个化学农药和6个生物农药，白僵菌是推荐的产品之一(农业农村部, 2019)。

白僵菌是研究应用最为广泛的广谱性昆虫病原性真菌之一，属于半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目丛梗孢科白僵菌属，应用较为广泛的有球孢白僵菌Beauveriabassiana和布氏白僵菌(卵孢白僵菌)B.brongniatii(高红等, 2011)。该菌分布广，寄生能力强且范围广，可侵染700余种昆虫和10多种蜱螨类害虫，且对人畜无害，因而已被广泛开发并应用于有害生物防治(田佳等, 2018)。我国关于白僵菌的研究与应用处于世界先进水平，白僵菌产量全球第一，已成功应用于大面积防治农林业害虫，如玉米螟Ostrinianubilalis、大豆食心虫LeguminivoraglycinivorellaMatsumura、松毛虫Dendrolimus等(李增智和樊美珍, 2000; 余素红等, 2009)。利用白僵菌防治草地贪夜蛾具有安全性高、可持续性好、害虫不易产生抗药性等优点。国外在利用白僵菌防治草地贪夜蛾方面也做了很多研究，如Gutierrez等(2018)分离出一株球孢白僵菌，处理72 h后草地贪夜蛾幼虫死亡率达100%。白僵菌还能够与多种杀虫混用，提高杀虫活性，减少化学农药的使用，如Rivero-Borja等(2018)研究发现白僵菌与多杀菌素联用对草地贪夜蛾幼虫具有增效作用。广东省植物重大灾害综合防控共性关键技术研发创新团队2019年5月初在广州地区调查草地贪夜蛾为害时，发现幼虫被真菌侵染和白僵虫，该项目团队随即对花都、番禺、增城等地草地贪夜蛾幼虫的僵虫率进行了调查，并对致病菌进行了分离和初步鉴定，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 草地贪夜蛾幼虫僵虫率调查

先后在广州市花都区花东镇联安村、番禺区大石街会江村、增城石滩镇旧山吓村玉米地进行调查，调查采用普查法和抽样调查法相结合。对发生较轻的玉米地，采用抽样调查法；对发生较重的农田，采用普查法。

抽样调查法：花都联安村调查地块玉米受害呈明显点片状，以每受害点为中心，调查直至无虫害状，然后根据玉米的密度，估算玉米总株数。普查法：增城、番禺两地为害较重，对试验田块所有玉米进行调查，采集幼虫，记录受害株数、总虫数。将典型被真菌感染的幼虫或虫尸单头置于指形管，以脱脂棉塞住管口，带回实验室置于温度27～29℃，相对湿度50%～70%，光周期L ∶D=16 h ∶8 h的培养箱中，幼虫以玉米嫩叶加人工饲料混合饲养至化蛹，连续观察幼虫的存活情况，死亡幼虫在上述环境保湿放置14 d，记录出现的僵虫数，计算僵虫比率。

1.2 白僵虫致病菌分离纯化

田间采集的白僵虫致病菌分离方法参考田佳等(2018)、冯玉元(2018)并适当调整。接菌后的PDA平板置于27～29℃，相对湿度50%～70%的培养箱培养。

方法一是选择虫体中部切成小块，浸入70%乙醇中3～5 min，取出后，再浸入次氯酸钠溶液2 min，然后用无菌水冲洗3次，取2～3块均匀放置于加有乳酸的PDA平板表面倒置培养。

方法二是以无菌接种针挑取虫体表面白色孢子粉，接种针置于PDA平板上方2～3 cm，轻拍手腕，观察有孢子落下后将PDA平板倒置培养。

由方法一和方法二分离的菌落再分离培养至菌落长出绒毛状菌丝后，切新生菌丝转移到水琼脂培养基，生长1 d后，用灭菌小手术刀挑取单根菌丝接在新PDA培养基培养。由2种分离纯化获得6株真菌，经形态学初步鉴定，每一株真菌都具有十分相似的菌落形态和显微形态，将其视为同一种菌，并命名为ZKQB3。

1.3 形态学鉴定

将ZKQB3接种到PDA培养基上，于27～29℃恒温培养箱培养,记录菌落特征及其直径。培养7 d时，待菌落表面有孢子粉时，挑取菌丝制成玻片在光学显微镜下观察孢子、孢子梗以及产孢结构。选取已明显产孢的PDA平板，挑取菌丝和孢子制片，采用Hitachi S-3000N扫描电镜观察超微结构。

1.4 分子生物学鉴定

PCR扩增：引物选取真菌常用的ITS1和ITS4，引物由广州华大基因公司合成。PCR反应体系：DNA 1L、ITS1 1L、ITS4 1L、Taq PCR mix液12.5L、无菌水9.5L。PCR反应条件是94℃ 3 min预变性；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 40 s，进行30循环后72℃延伸10 min。1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增成功后送往广州天一辉远基因科技有限公司测序。

根据测序结果，对序列进行编辑，去除两端质量差的碱基，将优化好的ITS序列提交到NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，使用BLAST程序进行比对。序列在BLAST后下载相似性大于84%的序列及其相关近缘属菌株的ITS序列，用MEGA 7.0进行序列处理，应用最大似然法(ML)，运行1 000次bootstrap验证，构建系统发育树。

1.5 菌株致病性及最适浓度测定

感染试验所采用的清水和对照均为含0.1%吐温-80和100 mg/L农用链霉素的无菌水，供试昆虫为草地贪夜蛾3龄幼虫。

1.5.1僵虫体表孢子致病性测定

以昆虫针轻挑或轻刮，并用无菌水冲洗僵虫表面，将表面白色孢子粉充分洗脱，再振荡15 min，制成孢子悬浮液，以血球计算板计数，然后稀释配制成浓度为1×105、1×106、1×107、1× 108cfu/mL的分生孢子悬浮液。将供试草地贪夜蛾幼虫在孢子悬液中浸3 s后取出，置于滤纸上，待虫体表面无明显液体时置于玻璃指形管中单头正常饲养。

1.5.2离体培养孢子致病性(活性)测定

选取分离并纯化的ZKQB3菌株在PDA培养15 d，刮取菌落表面孢子至0.1%吐温-80+100 mg/L农用链霉素的无菌水中，充分振荡后稀释成浓度为1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL的分生孢子悬浮液。浸染方法同1.5.1。

每浓度处理10头，重复3次；对照以无菌水处理，每天观察并检查死亡情况。死虫置于指形管、27～29℃培养箱保湿放置，连续观察15 d。将虫体僵硬、体表有菌丝或孢子长出的死虫判为僵虫，计算死亡率、侵染率。

2 结果与分析

2.1 草地贪夜蛾僵虫症状及发生率调查

2019年5月至6月，在广州的花都、番禺和增城等三区的4块玉米田调查均发现入侵草地贪夜蛾幼虫被寄生，白僵虫(图1)较为普遍。白僵虫虫体密被白色(孢子)粉，多数僵虫头向上，可见黑色头壳，多在植株中上部发生，心叶、喇叭口、末展开的雄蕊上僵虫数量多，个体大；完全展开的叶片上数量少，僵虫个体小。僵虫多为3～5龄幼虫，2龄幼虫的僵虫较少，末发现初孵幼虫和蛹被感染。

各调查点僵虫发生率有明显不同(表1)。5月6日花都联安村玉米地，该调查点玉米受害率较低，有明显的为害中心，玉米受害呈明显的片状，每个受害点约有10～15株玉米有明显的受害状，田间僵虫少，累积僵虫率为12.00%。5月10日番禺会江村玉米地，草地贪夜蛾发生普遍，玉米受害，受害率达89.00%，无明显的为害中心。调查前期连续降雨，湿度较大，玉米叶片及喇叭口有明显水珠，田间僵虫率为20.99%。采集的幼虫累积死亡率高，死亡幼虫保湿培养后呈明显的白僵虫症状，累积僵虫率43.21%。调查后即进行喇叭口颗粒施药，7 d后再次调查，玉米进入花粒期，雄蕊已完全展开，叶片受害较轻，新形成的虫孔少，果穗及未完全展开的雄蕊受害较重，田间僵虫自然发生率8.70%，僵虫累积比率为9.52%。6月5日旧山吓村，该调查点玉米田草地贪夜蛾发生普遍，除试验田块外，农田均以常规杀虫剂进行喷雾处理，玉米受害率下降。试验玉米田未进行药剂处理，玉米受害较重，受害率达78.00%，僵虫自然发生率为6.67，累积僵虫率为13.33%。

图1 草地贪夜蛾幼虫感染白僵菌症状Fig.1 Infection symptom of Spodoptera furgiperda larvae by Beauveria

表1 草地贪夜蛾幼虫僵虫发生率调查

2.2 形态鉴定结果

ZKQB3菌株在PDA培养基上菌落圆形，菌丝较茂密，短绒毛状，正面白色，背面淡黄色(图2-A1，A2)。经光学显微镜观察，3号菌株产孢细胞为瓶状，簇生于菌丝顶端或其分枝上，直或弯曲(图2-B2)。分生孢子透明，卵圆形或近球形，无色，表面光滑，大小为1.59～4.88 μm0.86～2.06 μm(图2-B1)。经扫描电镜观察，分生孢子卵圆形(图2-C1)，分生孢子簇生于分生孢子梗“之”字形分支末端(图2-C2)。根据培养基培养特征，其产生的分生孢子和产孢结构的显微和超微形态，鉴定菌株ZKQB3为白僵菌Beauveriasp.。

2.3 分子鉴定结果

以引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，对菌株ZKQB3测定所得ITS序列修剪编辑，去除两端质量不好的碱基，再导入NCBI中进行Blast比较，与球孢白僵菌Beauveriabassiana的同源性达到99%以上，和数据库中的球孢白僵菌聚成一簇，两者高度相似性。综合形态特征鉴定和ITS序列相似性分析，确定该菌株为白僵菌属球孢白僵菌。

图2 球孢白僵菌ZKQB3形态Fig.2 Morphology of Beauveria bassiana ZKQB3注：A，PDA菌落形态；B，光学显微形态结果(分生孢子和产孢结构)；C，扫描电镜超微结构(分生孢子和产孢结构)。Note: A, Colonial morphology on PDA medium; B, Optical microscopic morphology (conidiospore, sporulation structure); C, Scanning electron ultrastructure (conidiospore, sporulation structure)

图3 基于ITS序列ZKQB3菌株的系统发育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ZKQB3 strain based on ITS sequence

2.4 白僵菌菌株的致病性和最适浓度测定

僵虫体表和PDA平板上洗脱的孢子制成的孢子悬浮液均能感染草地贪夜蛾3龄幼虫，被感染幼虫症状相似，3 d时幼虫活动力下降，取食减少，生长缓慢，体长明显小于对照，通过体视镜放大，可观察到个别虫体侧面有菌丝；第4天有试虫死亡；处理后第5天，体表明显白色菌丝，显微镜下观察菌丝有隔，未观察到孢子。两种来源孢子对幼虫均有致病作用(表2)，浓度为1×107cfu/mL时的死亡率均为78.57%；浓度为1×108cfu/mL时的校正死亡率分别为85.71%和82.14%，且与1×107cfu/mL处理的效果差异不显著。

表2 僵虫体表和分离培养的白僵菌孢子对草地贪夜蛾幼虫的致病性

3 结论与讨论

虫生真菌种类多，代谢类型复杂，有显著的流行潜力和生产的便利性，在害虫的生物防治中有着极为重要的作用(王联德等, 2010)。本文的调查发现，刚入侵广州地区的草地贪夜蛾幼虫在田间有明显被真菌寄生现象，田间僵虫率在6%～21%之间，累积僵虫率最高达43.21%，说明广州地区具有天然的草地贪夜蛾寄生性真菌，利用虫生真菌防治该重大入侵害虫具有适合的环境和天敌微生物。

白僵菌是最重要的虫生真菌之一，也是一种优良的生物农药，能够寄生多种昆虫，其分生孢子与虫体接触后，在适宜温度和湿度条件下迅速萌发，侵入虫体，吸取虫体内水分和养分继续生长，最后虫体充满菌丝而死亡，死亡的虫体僵硬并发白，表面布满白色粉状分生孢子，向外飞扬，随风传播，感染其它昆虫，形成昆虫流行病(冯玉元, 2018)。昆虫被寄生而死，对人畜无毒副作用，对环境安全。本文的研究表明，导致广州地区草地贪夜蛾僵虫的主要致病菌为球孢白僵菌，菌株室内感染幼虫后出现白僵虫，试虫感染症状与虫体表面孢子直接感染的症状一致；对3龄幼虫有较好致病作用的孢子浓度为1107个/mL，累积死亡率与僵虫体表分离的分生孢子相当，表明菌株对草地贪夜蛾具有较高的致病性，具有进一步研究的价值。

通过对田间僵虫发生情况调查，发现广州地区白僵菌自然发生普遍，气候适宜，有利于应用推广利用生防真菌防治草地贪夜蛾。