不同地区沙田柚果园土壤细菌群落结构和多样性分析

彭玉娇，崔学宇，覃礼蒙，杨艳丽，邵元元，潘桂颖，黄 梅，曾文萍，贾书刚

（1.南宁师范大学广西地标作物大数据工程技术研究中心，南宁 530001；2.南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室，南宁 530001；3.南宁师范大学广西地表过程与智能模拟重点实验室，南宁 530001）

沙田柚（Citrus grandis var.shatinyu）是我国传统名柚，由于其具有经济效益高、适应性强的特点，在我国南方广泛种植[1]，沙田柚著名的产区包括容县、梅州、长寿等，在空间分布上具有较大的跨度，生态环境和气候特点差异较大。在土壤学研究中，土壤微生物群落结构和多样性特征是评价土壤质量的重要指标[2]。因此，解析不同地区沙田柚果园土壤细菌群落结构和多样性对不同地区沙田柚栽培管理、沙田柚果园的微环境调节、不同地区沙田柚果园土壤状况的评估具有重要的意义。土壤微生物在土壤中参与物质的形成与转化[3]，而土壤环境的差异也可以对土壤微生物产生直接的影响[4]。对不同类型小叶章湿地土壤细菌的研究表明，环境的差异对微生物有显著的影响[5]；对不同生态条件下香鳞毛蕨生长土壤微生物多样性的研究发现，土壤微生物多样性对土壤质量变化敏感，人为破坏少的地点微生物多样性高[6]；对红树林土壤微生物多样性的研究表明，北海和钦州红树林土壤微生物差异较大，证明了环境条件在微生物群落形成中的重要作用[7]；对不同生态环境野生樱桃李的研究表明，养分极显著影响土壤微生物数量[8]；对不同生态条件西瓜栽培土壤微生物多样性进行研究，证实连作降低了西瓜栽培土壤微生物的多样性[9]。在大空间尺度对土壤微生物研究报道多为野生植物，对某一栽培植物的报道并不多见，关于不同地区沙田柚果园土壤微生物多样性及群落结构并无报道。沙田柚是我国传统名柚，有必要对其产区土壤健康进行评估。在沙田柚主要栽培的5省（市）的7个县、区进行取样，测定沙田柚果园土壤的基本理化性质，并利用高通量测序的方法对土壤细菌群落结构和多样性进行研究，以明确不同地区沙田柚果园土壤和细菌群落的差异，为沙田柚栽培的精准管理提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 样地选择

取样的地点分别是广东省梅州市盘石村（MZ）、广东省清远市连山县吉田镇（LS）、广西壮族自治区桂林市阳朔县兴坪镇（YS）、广西壮族自治区玉林市容县容州镇（RX）、湖南省永州市江永县粗石江镇（JY）、四川省乐山市夹江县新乡（LeS）和重庆市长寿区邻封镇（CS），详见图1，取样地制图底图来源自然资源部监制GS（2019）1697号。7个县、区所选地区均为当地沙田柚种植核心区域，7个主产区处于我国南方地区，跨第二、第三阶梯，地势东西差异较大，地形复杂多样，主要包含平原、盆地、山地、丘陵、高原6种类型。在气候上，以热带亚热带季风气候为主，整体上呈现出夏季时高温多雨、冬季时温和少雨的特点。在如此气候环境下多发育形成红壤。所有选取的柚场均挂果10年以上，栽培密度为300～450株/hm2，选取的所有柚场均百株以上连片，选择的柚场1月内并未施用过肥料，管理为果农管理，所有沙田柚均为容县引种。

1.2 样品采集

所有样品均于2019年7月上旬取样（7月10日前完成全部取样），每个取样地点在果园中心随机选择3株长势均一的果树，取样地点远离施肥区，在树冠和树体近中处范围内采用五点法取样，取样时去掉表面杂草等杂物，取10～20 cm的表层土壤样品，混合后为一样本，每果园取3个样本，野外取样用具利用酒精和火焰灼烧灭菌，取样袋等用具室内灭菌后使用。全部21个样本用于果园土壤细菌高通量测序及土壤理化性质测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 测序前组DNA提取、PCR扩增、产物纯化

采用SDS法提取土壤总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度后，将稀释DNA浓度稀释至样本，终浓度为1 ng/μL。扩增引物使用带Barcode的细菌16S rDNA-V4区特异引物（515F和806R，引物序列分别为GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和GGACTACHVGGGTWTCTAAT）[10]，扩增利用New England Biolabs公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用Gene JET胶回收试剂盒回收产物。用干冰寄送至RCR产物利用琼脂糖凝胶检测，利用GeneJET胶回收试剂盒回收扩增产物[11]。测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成进行高通量测序。

1.3.2 土壤理化性质的测定

便携式土壤pH计测定土壤pH值；利用齐一生物科技有限公司提供的试剂盒测量土壤其他指标，具体测定原理参见《土壤农化分析》[12]（铵态氮、硝态氮、速效钾和无机磷）；土壤质量含水量利用烘干法测量。

1.4 数据分析与处理

Excel软件录入土壤理化指标，SPSS 23软件对其结果进行后续处理方差分析；下机数据导出fastq文件。根据barcode序列区分各个样本的数据。然后进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据，即Clean reads。Uparse软件进行土壤OTU聚类分析；Qiime软件（Version 1.9.1）计算进行Alpha多样性指数、和Beta多样性分析Diversity和并构建UPGMA样本聚类树；R软件（Version 2.15.3）进行绘制稀释曲线，Rank abundance曲线，物种累积曲线并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析后续制图。

2 结果与分析

2.1 不同地域沙田柚果园微生物群落多样性

本研究合计获得1 791 713条序列，其中有效序列1 681 255条，占总序列数的93.84%。获得可用于物种分类的OTUs 10 713条，至少涵盖60门，68纲，147目，275科，658属。21个样本获得的OTUs数在2 072～4 198之间；对于各组样本来说，来自长寿样本的OTUs数最小，来自江永样本的OTUs数最大。样本的OTU稀释曲线如图2所示，本研究所获得的稀释曲线已趋于平坦，证明测序量合理，更大的数据量只会获得少量新的OTUs。

利用花瓣图分析均一化处理后的各组样本之间共有、特有的OTUs。如图所示，合计969个OTUs为7个不同地区沙田柚果园所共有，特有OTUs最多的是连山的样品，特有OUTs数为645；最少的是长寿的样本，特有OTUs数为190（图3）。

图3 OTU分布图Figure 3 Diagram showing the distribution of OTUs

在97%一致性阈值下对7组样本的Alpha Diversity分析指数进行统计，结果如表1所示。本研究中，所有微生物群落多样性和丰富度的指标中来自江永的样本最高，来自长寿的样本最低。

表1 土壤细菌多样性指数Table 1 Diversity index of the soil bacteria

2.2 不同区域沙田柚果园土壤优势菌群分布

2.2.1 不同区域果园土壤微生物群落结构的差异

PCoA 分析（Principal Coordinate Analysis，主坐标分析）表明（图4）:49.56%的变量可以被解释。由图4可知，不同的地理位置，对细菌组成有影响。

2.2.2 不同地区土壤细菌门分类水平比较及聚类分析

在门分类水平对7组样本进行分析，样本细菌群落结构在门分类水平具有较高的多样性，对于不同样本来说，来自长寿的样本分离到的门数目最少，为33个；连山的最多，为49个。这些门主要包括变形菌门（Proteobacteria），不同样本的相对丰度在 33.61%～40.87%之间；厚壁菌门（Firmicutes），不同样本的相对丰度在0.71%～16.86%之间；酸杆菌门（Acidobacteria），不同样本的相对丰度在5.6%～23.48%之间；绿弯菌门（Chloroflexi），不同样本的相对丰度在1.99%～9.96%之间；芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），不同样本的相对丰度在3.80%～7.92%之间，这些优势菌门在7组样本的相对丰度比例在64.40%～88.25%之间。有2个菌门仅在容县的样本中发现，分别为Candidatus Staskawiczbacteria（相对丰度 0.013%）和 Candidatus Moranbacteria（相对丰度为0.0017%）；利用优势菌门结果对其进行聚类，结果由图5可知，在加权unifrac距离为0.07的水平上，7组样本被聚为3类，其中江永、连山、容县的样本被聚为1组，梅州、长寿、乐山的样本被聚为1组，阳朔的样本被单独划分为1组，这一结果表明，空间距离近的两地，细菌群落结构组成不一定聚在一起，仍需结合气候条件等对其进行深入分析。

图4 不同地区沙田柚果园土壤微生物群落结构的主坐标分析Figure 4 Principal coordinate analysis of soil microbial community structure of shatian pomelo orchard

2.2.3 不同地区沙田柚果园土壤细菌属分类水平分析

由图6可知，梅州和长寿的样本中，unidentified Burkholderiaceae是最优势属，相对丰度分别为5.25%和7.42%；连山的样本中Chujaibacter是最优势属，相对丰度为5.23%；容县的样本中肠球菌属（Enterococcus）是最优势属，相对丰度为6.45%；江永和乐山的样本中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是最优势菌属，相对丰度分别为3.61%和6.74%；阳朔的样本中unidentified Acidobacteria是最优势菌属，相对丰度为3.29%。与门水平的结果不同，优势菌属在不同样本中存在地域差异，7组样本优势属差异显著。

2.3 不同地区沙田柚果园高丰度土壤细菌潜在功能分析

图5 细菌门分类水平的聚类图Figure 5 UPGMA cluster analysis of bacteria relative abundance on phylum level

图6 细菌属分类水平的比较Figure 6 Comparison of bacteria groups at genus level

对不同样本中高丰度的土壤细菌进行具体分析（丰度＞0.1%），本研究的7组样本中，高丰度属合计162个，高丰度种合计74个。

分析不同地区果园土壤重要的细菌潜在植物致病菌发现，在长寿、连山、容县、江永和阳朔5地假单胞菌属（Pseudomonas）具有较高丰度，其中容县的样本相对丰度达3.34%；在容县的土壤样本中红球菌属（Rhodococcus）具有较高的相对丰度为0.13%；在容县和江永的样本中芽孢杆菌属（Bacillus）相对丰度分别为0.24%和0.29%具有较高的相对丰度；在梅州、连山、容县、江永的样本中链丝（霉）菌属（Streptomyces）具有较高的相对丰度分别为0.97%、0.21%、0.16%和0.39%；在梅州、连山、容县的样本中雷尔氏菌属（Ralstonia）的相对丰度分别为0.50%、0.36%和0.14%，应注意这些菌属的潜在致病风险。

对其相对高丰度种进行研究发现，Sphingomonas sp在梅州、乐山、容县、江永和连江都有较高的相对丰度，均大于0.2%；在容县和连江的样本中，大肠杆菌（Escherichia coli）具有较高的相对丰度，分别为0.6%和0.2%，在容县的样本中，肠道致病厌氧菌脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）丰度较高，达0.5%；具有潜在多菌灵降解功能的Nocardioides sp在乐山、容县、江永和连江具较高的相对丰度，相对丰度分别为0.19%、0.23%、0.14%和0.30%；烷烃降解菌香茅醇假单胞菌（Pseudomonas citronellolis）在容县的样本中相对丰度为1.01%，；耐久肠球菌（Enterococcus durans）在容县的样本中有相对丰度为4.27%，该菌株可能为肠道来源。

2.4 不同区域沙田柚果园土壤理化性质的差异及对土壤微生物的影响

本研究对7个果园土壤硝态氮、铵态氮、无机磷、速效钾、pH值和土壤含水量进行测定，结果见表2。由表可知，不同沙田柚果园土壤理化性质之间有较大的差异；土壤理化性质中的硝态氮、速效钾、无机磷3个指标对土壤微生物多样性影响较大（图7），其中速效钾和无机磷影响α多样性全部指标，速效钾影响更大；硝态氮主要影响了群落物种多样性的指标（Simpson、Shannon指数）。

表2 不同地区沙田柚果园土壤理化性质Table 2 Soil physical and chemical properties of Shatian pomelo cultivated with different areas

图7 热图分析细菌α多样性与环境因子相关性Figure 7 Heatmap correlation between alpha diversity of bacteria genus and soil physico-chemical properties

对微生物属水平和土壤理化指标进行冗余分析，在微生物的属水平，80.55%的细菌群落变化可以被研究所测量的环境因子所解释。土壤理化因子与属水平细菌的相关性分析见图8，铵态氮显著影响3个属的细菌OTUs；硝态氮与6个属细菌显著或极显著正相关，与3个属细菌显著或极显著负相关；速效钾与10个属细菌显著或极显著正相关，与1个属细菌显著负相关；无机磷与8个属细菌显著或极显著相关，与1个属细菌显著负相关；pH与2个属细菌显著正相关；土壤含水量与1个属细菌显著正相关，与2个属细菌显著或极显著负相关。

图8 不同地区环境因子对细菌群落结构的冗余分析Figure 8 Redundancy analysis based on the soil properties and the bacterial community structure

3 讨论与结论

沙田柚因其具有较高的经济价值和较强的适应性在我国南方广泛种植[13]，由于其栽培地域跨度大，栽培地拥有不同的生态类型和气候条件。本研究在沙田柚7个主要产区的规模化沙田柚栽培果园进行取样，对沙田柚果园土壤细菌群落结构和多样性进行研究，在微生物的角度解析不同地区沙田柚果园的栽培土壤特性。在这7个主要产区中来自永江的样本细菌群落多样性和丰富度最高，而来自长寿的样本则最低。调研发现，永江、容县有机肥施用较多，而长寿、梅州化肥施用较多，前人研究有机肥的部分替代可提高微生物群落物种丰富度结果为这一推测提供了支持[14]。

生物学家Baas Becking对微生物的分布有一种假说“Everything is everywhere,but the environmentselects”，即环境因素是决定微生物群落结构的关键，地理的空间屏障并不是其决定因素[15]。门水平的聚类结果对其进行了一定的证实，空间距离越近的两地，微生物在门水平不一定聚在一起，这可能是受到小气候环境的影响。在门水平分析，在容县的样本中变形菌门和厚壁菌门是相对丰度最高的两个门，这一结果与本课题组先期在容县的其他柚场春季沙田柚果园土壤微生物中的研究类似[16]，这两次研究在容县不同的沙田柚场取样，证明了土壤细菌在一定空间范围上的稳定性；此外变形菌门在所有的沙田柚果园土壤样本中均具有最高的相对丰度，这一结果与前人在其他果园中的研究结果类似[17]，产生这一结果的原因可能和变形菌门自身为富养菌的特性有关[18]；梅州、乐山、阳朔和长寿的样本中，相对丰度第二高的是酸杆菌门，在其他的样本中也具有较高的相对丰度，这一结果与土壤pH的结果对应发现，虽然沙田柚栽培土壤的pH均为酸性，但4地的pH值与其他地区的相比较低，存在显著差异，这可能与酸杆菌门自身的嗜酸性相关[19]。

图9 热图分析主要细菌属水平OTUs与环境因子相关性Figure 9 Heatmap correlation between dominant OUTs of bacteria genus and soil physico-chemical properties

研究表明，土壤的理化性质、果树的种类和栽培方式可能造成果园土壤微生物群落的差异[20-21]。本研究在属水平对沙田柚栽培土壤进行分析发现，不同地区样本在属水平差异较大，产生这种差异的原因可能是土壤的理化性质和不同地区的栽培方式导致。土壤细菌在特定的环境下可能产生某些特定的功能，目前土壤中的微生物只有不到0.3%可以被培养[22]，因此利用高通量测序的方法是在自然状态下研究土壤细菌群落和功能有效的手段。本研究获得了658属的细菌，相对丰度前30的菌属中，有8个属在数据库中被定义为unidentified，这一结果既证明了高通量测序的灵敏性，又证明土壤细菌群落功能的复杂性，对其详尽的解析仍是一个艰巨而又复杂的任务。本研究发现容县的样本中，肠球菌属的相对丰度较高，对其具体分析发现，是肠球菌属耐久肠球菌具有较高的相对丰度，该菌在肠道中具有发酵的功效，其原因可能是容县在大力推广有机肥替代化肥的项目，动物粪便有机肥经沤肥后施用所导致。

本研究对7个地区果园高丰度的微生物进行潜在功能分析，在5个地区检测到植物潜在致病种Sphingomonas sp.，该种在多种植物中有致病的报道[23-25]，且在沙田柚栽培区广泛的高丰度，有必要对其进行防范；在容县和连江的样本中，发现动物肠道潜在致病菌Escherichia coli相对丰度较高，该菌在土壤中有将食草动物肠道致病、污染山下水源、甚至进入植物组织的风险[26]，此外，容县的样本中有发酵功能的Enterococcus durans[27]和潜在肠道致病菌Bacteroides fragilis[28]都有较高的相对丰度，其来源推测是动物粪便来源有机肥自身携带，故施用动物粪便源有机肥之前必须先进行无害化处理，Nocardioides sp.有潜在多菌灵降解功能[29]，这可能与种植地的农药使用方式有关，并且有潜在修复环境的应用价值，Pseudomonas citronellolis在容县的样本中有最高的相对丰度，该菌的存在可能降低氮肥的利用效率[30]。

本研究对不同沙田柚果园的土壤理化因子与细菌的多样性关联分析结果表明，速效钾和无机磷影响α多样性全部指标，速效钾影响更大；硝态氮主要影响了群落物种多样性的指标（Simpson、Shannon指数）。此外，本研究测试的5个土壤理化因子在细菌属水平解释了80.55%的贡献率，说明土壤的理化性质可能是影响沙田柚栽培果园土壤细菌群落结构和多样性的主要因素。

本文对不同沙田柚栽培主产区果园土壤细菌群落结构和多样性进行研究。结果表明7个地区沙田柚栽培果园土壤中，来自长寿的土壤样本细菌多样性最低，有必要利用施用有机肥等措施对其进行修复；在门水平，变形菌门是全部样本最优势菌门，在属水平，不同样本之间差异较大；栽培方式的差异可能是造成土壤细菌群落结构和多样性有差异的重要原因，施用粪便来源有机肥之前，必须对其进行充分发酵和无害处理；硝态氮、速效钾、无机磷是影响土壤细菌多样性的主要因素。