蛹虫草菌丝体蛋白高通量发酵生产技术研究*

刘广建，郑惠华，张 辰，蒋 益，薛 璟，桑 花，田贞乐，季宏更，张 蕾

（1.江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214063；2.江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通226009）

蛹虫草（Cordyceps militaris）是麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps）真菌。蛹虫草子实体蛋白质含量高，氨基酸种类齐全[1]；蛹虫草蛋白中含有许多功能活性成分，如活性蛋白多肽、多糖肽等。食用菌活性蛋白具有提高人体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等功效，药用保健价值高[2-3]。目前食用菌蛋白的来源除了食用菌子实体蛋白，还可通过食用菌液体发酵获得大量的菌丝体，并通过提纯获得菌丝蛋白。

蛹虫草高通量发酵技术研究，主要是在菌丝快速生长阶段，通过补料维持适宜的发酵条件，使菌丝持续快速生长。梁恒宇等[4]在产赖氨酸大肠杆菌工业化发酵生产L-赖氨酸的研究中，利用高通量生物反应器，以在线监测pH为直接反馈补料信号，以葡萄糖、氨水和硫酸铵混合溶液为流加液进行补料发酵生产赖氨酸，可使赖氨酸产量大幅提高。但此方式在蛹虫草等大型食用菌液体发酵中还未见报道，而蛹虫草高通量发酵可以在短时间内获得大量质量稳定、安全可靠的蛹虫草菌丝体蛋白，可作为蛋白质食品加工的来源。因此，试验通过研究补料发酵中发酵液pH变化与还原糖消耗的关系，建立pH与还原糖的反馈信号，并进行分段补料发酵。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

蛹虫草菌株（SWAHcor-15003），江苏省苏微微生物研究有限公司通过常压室温等离子体（ARTP）诱变选育的高产菌丝体蛋白液体发酵菌株。

1.1.2 培养基

酵母膏 0.8%、蛋白胨 0.6%、葡萄糖 2.0%，MgSO40.05%、KH2PO40.10%，维生素 B110 mg·L-1。

1.1.3 补料液

每3.5升补料液，含浓氨水96 mL、葡萄糖1 200 g、酵母膏360 g。

1.1.4 主要仪器和试剂

HYL-A全温摇瓶柜，江苏太仓强乐实验设备有限公司；200 L液体发酵罐，江苏镇江江工生物成套设备有限公司；紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；KT260定氮仪，福斯赛若分析仪器有限公司；25.0%～28.0%氨水，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 液体发酵最佳培养基的研究

运用响应面分析法，试验以酵母膏、蛋白胨、葡萄糖为发酵基础培养液进行单因素发酵研究，在单因素分析的基础上利用Box-Benhnken方法进行3因素3水平试验设计，以菌丝体生物量为响应值，进行响应面分析得到优化组合条件，试验数据使用Excel进行整理和绘图，同时利用Design-Expert 8.0统计分析软件进行多元二次回归模型方程的建立及方差分析，运用该软件中响应面值优化程序求得当响应面值最大时各因素的最佳组合。响应面试验因素水平见表1。

表1 最佳培养基的响应面分析试验因素水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis of the fittest medium

1.2.2 高通量液体发酵研究

1）未调控pH的蛹虫草普通一段式液体发酵参数

试验以500 mL摇瓶装发酵液100 mL（响应面分析得到的最佳培养基）进行蛹虫草菌丝液体发酵，培养温度26℃，转速150 r·min-1。考察不同时间段发酵液pH、还原糖，菌丝体生物量及菌丝生长速率变化。

2）调控pH的蛹虫草高通量液体发酵参数研究

蛹虫草菌丝的最适生长 pH 为 5.4～6.8[5]，试验以500 mL摇瓶装发酵液100 mL（响应面分析得到的最佳培养基）进行蛹虫草菌丝液体发酵，根据不同时间段的pH，用浓氨水进行pH调控，将pH始终调控为5.8左右，考察不同时间还原糖、菌丝体生物量以及不同时间段的菌丝生长速率变化。

3）蛹虫草高通量发酵的补料发酵研究

试验以500 mL摇瓶装发酵液100 mL（响应面分析得到的最佳培养基）进行蛹虫草液体发酵，通过pH监控，在pH到达一定的值时加入补料液，其中浓氨水直接加入。试验连续补料4次，考察还原糖、菌丝体生物量的变化，根据发酵液的浓稠程度调整摇床转速，以找到蛹虫草高通量液体发酵的最佳参数。

4）工业化蛹虫草高通量补料发酵试验

发酵试验同时进行了工厂化普通一段式液体发酵和高通量补料发酵，考察2组发酵方式发酵情况。发酵罐（通气加搅拌） 容积200 L，装液量120 L，通气量 1 ∶（0.5～1.0），压差法接种，接种量为 8%，添加0.1%豆油作为消泡剂，25℃～26℃条件下培养。普通一段式液体发酵以搅拌转速150 r·min-1发酵直至发酵结束；高通量补料发酵采用同样发酵条件，开始时搅拌转速150 r·min-1，根据发酵情况调整转速，根据3） 摇瓶高通量发酵的最佳参数，进行工业化高通量补料发酵试验，确定最佳发酵参数。

5）蛹虫草菌丝体真蛋白检测

工业化发酵的蛹虫草菌丝体在离心、烘干后进行菌丝体蛋白测定时，因在补料发酵过程中使用了氨水，会使发酵液中含有许多铵盐成分。试验后菌丝体虽然进行了洗涤，但还是有可能吸附了一定量的铵盐成分。直接凯氏定氮法检测[6]，蛋白数值会偏高。试验运用程淑华[7]真蛋白检测方法进行菌丝体蛋白的测定，用氢氧化铜沉淀真蛋白，后用热蒸馏水洗涤氨化含氮物，再用凯氏定氮法进行测定，连续3次重复测定。菌丝体蛋白含量（W，g·100-1mL-1）的计算公式如下：

式中：M为菌丝体生物量（g·100-1mL-1）；m为菌丝体蛋白得率（%）。

2 结果与分析

2.1 液体发酵最佳培养基的确定

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏3个因素为自变量，以蛹虫草菌丝体生物量为响应值，采用响应面法进行3因素3水平的试验设计，共包括17组试验方案，试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Tab.2 Response surface test design scheme and results

利用设计软件Design-Expert对表2数据进行多元回归拟合，获得二次多项回归方程菌丝体生物量Y的计算公式：

式中：A为葡萄糖值、B蛋白胨值、C为酵母膏值。

回归模型方程的ANOVA分析结果见表3。

表3 响应面试验回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface test regression model

由表3可知，拟合方程具有较高的F值（F=76.03） 和非常低的P值（P<0.000 1） 说明回归方程达到极显著水平（P<0.0001，R2=0.971 5）；失拟项的P=0.939 3＞0.05，试验数据与模型预测数据差异不显著，表明该拟合方程与实际拟合较好。另外设计软件Design-Expert得出试验结果相关系数模型的决定系数R2为0.971 5，表明菌丝体生物量的试验值与预测值有较好的一致性，调整决定系数R2adj为0.976 9，说明该模型能解释97.69%响应值变化。该二次回归模型拟合程度好，试验误差较小，可用该模型方程对液体发酵培养基最佳条件预测和分析。

由F值可以看出3个因素对菌丝体生物量的影响程度由大到小依次为葡萄糖（A） ＞酵母膏（C） ＞蛋白胨（B）；由响应面模型分析得出最佳的培养基参数为葡萄糖3.0%、蛋白胨0.4%、酵母膏1.0%，菌丝体生物量为1.644 0 g·100-1mL-1。

2.2 液体发酵参数试验结果

不同时间段100 mL发酵液蛹虫草菌丝生物量和菌丝生长速率的变化见图1。

由图1可看出，随着时间的变化，菌丝体生物量不断增加，但发酵末期生物量几乎未有变化；调节发酵液pH组的生物量一直比未调节pH的高，如在48 h时生物量相差0.155 g，但后期120 h时生物量相差仅0.05 g，在144 h发酵结束时生物量分别为1.612 g·100-1mL-1、1.615 g·100-1mL-1几乎相同，说明发酵过程中调节适宜pH可以加快菌丝生长，但若不补充碳氮营养，发酵后期会随着碳氮营养的消耗，总生物量将不再发生变化。调节发酵液pH的蛹虫草菌丝生长速率在0～72 h比未调节高，后期却降低，说明需要补充碳氮营养，以提高菌丝的生物量；同时发现在整个发酵过程中，在48 h～72 h时间段蛹虫草菌丝生长速率最高，调节pH和未调节pH分别达到 0.014 3 g·h-1、0.013 8 g·h-1。100 mL 发酵液补料时的pH及还原糖参数见图2。

由图2可看出，随着时间的变化还原糖含量不断减少，到后期几乎未有变化。开始时发酵液的pH为5.22，100 mL发酵液加入40 μL浓氨水可调节pH到 5.80，48 h 后 pH 降至 4.15，加入氨水 80 μL 可调节 pH为5.80。在发酵开始时的还原糖为 30.49 mg·mL-1，调节pH和未调节pH的发酵液48 h时的还原糖含量分别为17.97 mg·mL-1、18.82 mg·mL-1，128 h时分别为 2.68 mg·mL-1、3.06 mg·mL-1，在 48 h 碳源营养消耗约1/3。

由图2可看出，在48 h快速生长阶段初期进行补料，这时对应的pH为4.10～4.20，发酵液还原糖在18 mg·mL-1左右，碳氮营养消耗1/3左右，因此在补料时考虑添加80 μL氨水调节pH和添加1/3的碳氮营养即100 mL发酵液添加1.0 g葡萄糖、0.3 g酵母膏，氨水可代替部分氮源。

2.3 蛹虫草高通量发酵的补料发酵研究

在发酵参数研究的基础上分别进行摇瓶及发酵罐补料发酵研究，发酵开始，摇瓶用40 μL氨水调节pH，发酵罐用50 mL氨水调节pH，pH在4.10～4.20，发酵液还原糖含量约18 mg·mL-1时进行补料，每次补料时调节pH为5.8；每次补料每瓶摇瓶加3 mL补料液，发酵罐加3.5 L补料液。开始摇床转速150 r·min-1，第 2 次补料时转速 180 r·min-1，第 4 次补料时转速220 r·min-1，直至发酵结束。发酵罐开始搅拌时转速180 r·min-1，第2次补料时转速220 r·min-1，第 4 次补料时转速 300 r·min-1，直至发酵结束。摇瓶补料发酵情况见表4。

表4 摇瓶补料发酵情况表Tab.4 Resuts of supplementary fermentation in shake-flask

由表4可看出，pH 在 4.10～4.20时，发酵液还原糖含量约18 mg·mL-1，说明发酵补料的时间点及补料的碳氮营养比例适宜，摇瓶发酵结束时菌丝体生物量为2.316 g·100-1mL-1，比未补料发酵菌丝体生物量 1.612 g·100-1mL-1提高了 43.8%，因此以该参数进行发酵罐的高通量补料发酵研究。200 L发酵罐补料发酵情况见表5。

表5 200 L发酵罐补料发酵情况Tab.5 Resuts of supplementary fermentation in 200 L fermentation tank

由表5发酵罐数据可知，摇瓶及发酵罐补料发酵的数据有一致性。在 pH 4.10～4.20，对应发酵液还原糖18 mg·mL-1左右时进行补料发酵，发酵69 h就可结束发酵，菌丝体生物量为2.362 g·100-1mL-1，达到了高通量发酵的理想结果。

2.4 蛹虫草菌丝体真蛋白检测

200 L发酵罐蛹虫草发酵液，直接运用凯氏定氮法测定菌丝体蛋白得率达到51.43%。采用真蛋白检测方法[7]，菌丝体蛋白质得率为46.5%。摇瓶及发酵罐一段发酵与补料发酵情况对照情况见表6。

表6 摇瓶及发酵罐一段发酵与补料发酵情况对照表Tab.6 Comparison of ordinary fermentation and supplementary fermentation in shake-flask and fermentation tank

由表6发酵数据可知，普通一段发酵主要考察发酵参数，了解菌丝生长状况，为高通量发酵提供介入点，同时发酵参数又可作为高通量发酵的对照。200 L发酵罐工业化发酵生产高通量液体发酵，发酵时间69 h，比普通一段式发酵时间缩短3 h；菌丝体蛋白含量达到1.098 g·100-1mL-1，比普通一段式发酵菌丝体蛋白含量 （0.651 g·100-1mL-1）提高 68.92%[8]。

3 讨论与结论

已有研究中，微生物可通过流加、分段补料等方式进行液体高通量发酵，均取得了理想的成果，梁恒宇等[4]的研究结果表明，在赖氨酸发酵的不同阶段采用不同配比的流加液进行分段式培养可以进一步提高赖氨酸的产酸浓度，同时降低残糖和残铵氮含量。三段式pH反馈补料发酵可以将赖氨酸产酸浓度提高到 （56.85±0.98） g·L-1，与二段式和一段式相比分别提高8.65%和23.64%。项目组根据单位现有发酵条件，采用分段式高通量液体发酵方式进行了蛹虫草的液体发酵研究。试验通过响应面分析法得到了最佳培养基为葡萄糖3.0%、蛋白胨0.4%、酵母膏 1.0%，MgSO40.05%、KH2PO40.10%、维生素 B110 mg·L-1。通过蛹虫草高通量发酵研究得到最佳发酵参数为200 L发酵罐每次补液量3.5 L（包含浓氨水96 mL、葡萄糖1 200 g、酵母膏360 g），在38 h、42 h、48 h、54 h进行4次补料，整个发酵结束时间 69 h，菌丝体生物量 2.36 g·100-1mL-1，菌丝体蛋白得率 46.5%，菌丝体蛋白含量 1.098 g·100-1mL-1，比普通发酵菌丝体蛋白含量提高68.92%。

蛹虫草SWAHcor-15003诱变高蛋白菌株在普通一段式发酵菌丝体蛋白得率为40.9%[8]，而通过补料进行的高通量发酵后蛋白含量有一定的增加，说明在发酵过程通过添加氨水调节pH及补料发酵可提高发酵产物蛋白质含量；通过对pH、还原糖等一些发酵参数的实时监控，以pH及还原糖为反馈数据进行食用菌高通量液体发酵的方式证明可行，后续可进行食用菌流加补料高通量发酵的相关研究。