人乳腺癌端粒酶基因RNA与雌激素受体、细胞周期蛋白B1、C-erbB-2相关性研究

唐加步，姚运红△，欧阳清，黄 冰

(1.广东医科大学东莞校区病理学系，广东 东莞 523808；2.东莞市东城医院病理科，广东 东莞 523000;3.广东医科大学湛江附属医院病理科，广东 湛江 524000)

端粒酶作为一种RNA依赖特殊DNA聚合酶，是一种特异合成端粒DNA的逆转录酶，是一种蛋白质与RNA组成的核糖核蛋白体。有研究表明，端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生密切相关，其活性的维持对恶性肿瘤的发展和患者预后也十分重要[1]。G2/M期转换的关键调控分子为细胞周期蛋白B1(CyclinB1)/P34CDC2复合物，CyclinB1在S期开始合成，G2期定位于细胞质中，与P34CDC2结合形成有丝分裂促进因子，促进细胞从G2期进入M期，从而完成有丝分裂。癌基因——C-erbB-2基因位于第17号染色体q21带上，参与正常细胞的生长、分化和分裂，受到体内外某些因素作用后可被激活，具有肿瘤转化活性。C-erbB-2在乳腺癌中的表达与组织学分级、淋巴结转移等有关。本研究探讨了人乳腺癌端粒酶基因RNA(hTR)、CyclinB1、雌激素受体(ER)、C-erbB-2基因的表达、临床意义及相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 选取2012—2013年在广东医科大学湛江附属医院接受乳腺癌根治术的乳腺癌患者70例，患者年龄16～67岁；其中浸润性导管癌65例，浸润性小叶癌5例；淋巴结转移28例(40.0%)。70例患者术前均未给予任何抗癌治疗，病理资料完整。

1.1.2试剂 (1)原位杂交试剂：地高辛标记的hTR-cRNA探针、蛋白酶K、马血清、缓冲液和四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸显色液均由北京大学医学部病理系提供。(2)免疫组织化学试剂：ER、CyclinB1、C-erbB-2基因单克隆抗体，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)试剂盒和DAB显色试剂盒均为即用型，均由北京中杉金桥生物技术有限公司生产。ER、CyclinB1、C-erbB-2基因单克隆抗体SP试剂盒产品批号分别为E749809E、K126614B、C123406B；粘片剂氨醛酸乙基硅由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1标本处理 70例乳腺癌患者标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋。以4 μm连续切片，每个蜡块均有苏木精-伊红染色对照片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗及用不加一抗的切片作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.2.2病理检查 70例乳腺癌患者标本均经常规苏木精-伊红染色后由3位病理医师确诊。肿瘤病理分型、淋巴结转移、肿瘤大小及相关临床参数均参照国际标准。hTR检测采用原位杂交方法，ER、CyclinB1、C-erbB-2检测采取免疫组织化学SP法。

1.2.3结果判断 由2名经验丰富的病理医师采用双盲法至少观察5个具有代表性高倍视野，不少于1 000个细胞，染色细胞数超过10%者判断为ER、C-erbB-2、CyclinB1表达阳性，否则为表达阴性。hTR阳性表达为细胞核和细胞质着色，阳性信号为蓝紫色颗粒；阴性为细胞不显色。以不加探针及RNA酶处理切片作为阴性对照。乳腺癌组织ER阳性物质定位于细胞核，阳性反应为细胞核内出现棕黄色颗粒。CyclinB1阳性物质定位于细胞核，C-erbB-2基因定位于细胞膜，阳性反应为细胞膜上出现棕黄色颗粒。见图1～4。

阳性物质定位于细胞核和细胞质，呈蓝紫色颗粒。

阳性物质定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。

阳性物质定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。

1.3统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验。采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

阳性物质定位于细胞膜，呈棕黄色颗粒。

2 结 果

2.1hTR、ER、C-erbB-2、CyclinB1表达与临床病理指标的关系 肿瘤大小、是否淋巴结转移、不同组织分级患者hTR表达阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同病理类型患者hTR表达阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。是否淋巴结转移患者ER、C-erbB-2、CyclinB1表达阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。不同组织分级、肿瘤大小患者CyclinB1表达阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。不同病理类型、肿瘤大小、组织分级患者ER、C-erbB-2表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。ER与淋巴结转移呈负相关(r=-0.329，P<0.05)，C-erbB-2、CyclinB1均与淋巴结转移呈正相关(r=0.467、0.548，P<0.05)，CyclinB1与组织分级和肿瘤大小呈正相关(r=0.589、0.568，P<0.05)。

表1 hTR、ER、C-erbB-2、CyclinB1表达与临床病理指标的关系[n(%)]

2.2hTR与ER、C-erbB-2、CyclinB1表达的相关性 腺癌组织hTR表达水平与ER无关(r=0.167，P>0.05)，与C-erbB-2、CyclinB1呈正相关(r=0.439、0.354，P<0.05)。

2.3ER与C-erbB-2、CyclinB1表达的关系 乳腺癌组织ER表达水平与C-erbB-2、CyclinB1表达均呈负相关(r=-0.402、-0.376，P<0.05)。

3 讨 论

HIYAMA等[2]和YASHIMA等[3]认为，端粒酶表达与乳腺癌大小、淋巴结转移、临床分期及肿瘤进程有关，可作为判定乳腺癌患者预后的指标。本研究结果显示，hTR表达阳性率与肿瘤大小、淋巴结转移和组织分级有关，支持hTR可作为判定乳腺癌患者预后的指标。

乳腺癌是一种雌激素依赖性肿瘤。近年来，对ER在乳腺癌中的作用的研究较多。本研究结果显示，ER表达阳性率随组织分级增加，随淋巴结转移而降低，ER表达水平与淋巴结转移呈负相关(P<0.05)。提示ER表达阴性的肿瘤恶性程度高，淋巴结转移可能性大，患者预后不良。所以，对ER阴性患者即使是未见淋巴结转移也应重视术后的综合治疗。本研究结果显示，乳腺癌组织hTR表达水平与ER无关，提示乳腺癌的端粒酶激活可能与乳腺癌的雌激素因素无关。

C-erbB-2基因是表皮生长因子受体家族成员之一，位于染色体17q21，又称为neu基因。C-erbB-2基因的异常表达明显增加了乳腺癌转移的风险，并降低了乳腺癌患者生存率[4]。C-erbB-2基因被认为是肿瘤患者预后不良相关的一个标记物，其过度表达与肿瘤细胞侵袭性、抗激素治疗及总体低生存率明显相关[5]。本研究结果显示，C-erbB-2与淋巴结转移呈正相关，支持其可作为判断乳腺癌患者预后的重要指标。C-erbB-2与ER表达呈负相关，乳腺癌患者ER阳性者内分泌治疗有效且预后较好，C-erbB-2的过度表达说明癌基因激活，使乳腺癌依赖激素生长的特性受到抑制，不能对内分泌治疗产生反应[6]。乳腺癌组织hTR表达与C-erbB-2呈正相关，提示乳腺癌端粒酶激活可能与C-erbB-2基因有关。

人类多种肿瘤(如食管癌、非小细胞性肺癌等)均发现有CyclinB1的表达。有研究表明，乳腺癌的发病与多种细胞周期调控因子的异常表达相关[7-8]。乳腺癌有丝分裂指数和增殖指数与CyclinB1表达有关[9-10]，表明CyclinB1可干预G2/M期调控，促进细胞的异常分裂、增殖。DING等[11]研究发现，CyclinB1可作为判断ER+乳腺癌患者预后的标志物，其发现CyclinB1对ER+乳腺癌患者无远处转移生存率、无病生存率、无复发生存率和总生存率均具有显著的预测能力。本研究也发现，CyclinB1表达水平与hTR呈正相关，与ER呈负相关。表明在乳腺癌发生的过程中可能存在端粒酶激活与细胞周期关键调控因子CyclinB1异常表达的协同机制，但尚需进一步研究证实。