5-氟尿嘧啶区域动脉灌注对SAP大鼠细胞凋亡的影响

张旭升，李晓娟

(甘肃省第二人民医院：1.普外科；2.内分泌科，甘肃 兰州 730000)

急性重症胰腺炎(SAP)属普外科常见急腹症，常因胆总管结石嵌顿或Oddish括约肌痉挛所致。约20%的急性胰腺炎患者可进展为SAP，若不及时干预还可引发全身炎症反应综合征等[1-2]。以往多采用手术清除坏死组织治疗SAP，但开腹手术较难彻底清除胰腺及胰周坏死组织，且可能引发内环境紊乱，增加发生大出血、腹腔感染等并发症的风险[3]。故近年来，临床多推荐给予非手术治疗。有研究证实，区域动脉灌注在SAP治疗中效果较理想，可经胰腺病变部位供血动脉置入导管，通过导管输注治疗药物，使胰腺局部药物浓度提升，达到治疗的目的[4]。但国内就SAP区域动脉灌注治疗的相关研究仍较少，特别是对胰腺腺泡细胞凋亡分析的相关研究较少，且受实验性模型动物血管分离难度大、临床影像学支持不够等因素影响，仍缺乏合理、规范的实验性区域动脉灌注模型。此外，动脉药物选择也是影响SAP区域动脉灌注治疗的关键。5-氟尿嘧啶(5-FU)属常用抗代谢药物，可抑制SAP时的高炎性细胞因子血症，通过抑制免疫过激的方式缓解SAP的病理生理学异常，达到治疗的目的。但5-FU常规全身静脉给药具有一定的毒性[5]。本研究创建了SAP大鼠模型，重点分析了5-FU区域动脉灌注对大鼠细胞凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1一般材料 2019年10月选取健康成年雄性SD大鼠(甘肃中医药大学SPF实验动物中心提供)24只，体重252～305 g，平均(285.60±5.55)g。本研究已获得本院伦理委员会审核批准。

1.1.2仪器与试剂 仪器包括600E-2487系列高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Fresco 21超高速离心机(德国Thermo公司)、全自动生化仪(美国贝克曼库尔特公司)、全自动酶标仪EL×800(厦门宝特科技有限公司)、显微镜[奥林巴斯(日本)有限公司]等。试剂包括5-FU注射液(上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020593)、5-FU标准品(美国Sigma公司)、酶联免疫吸附试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)、苏木精-伊红(HE)染色液(北京索莱宝科技有限公司)、原位末端标记法凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)等。

1.2方法

1.2.1SAP模型创建与分组 24只大鼠均采用逆行胰胆管注射法创建SAP模型。术前禁食12 h，可自由饮水。给予10%水合氯醛3 mL/kg进行麻醉。取上腹正中切口，自剑突下1.0 cm向下剪开1.5～2.0 cm切口。经腹白线剪开肌肉，注意保护肝脏。以拉钩打开两边皮肤、肌肉，暴露内脏。探查胰十二指肠，十二指肠翻开拉向左侧，暴露脂肪状胰腺。肝脏内稍倾斜乳白色管状结构即为胰胆管。逆行胰胆管，以5%牛磺胆酸钠微泵泵入，创建SAP模型。术毕连续缝合皮肤、肌肉组织。术后常规保暖，禁食，不禁饮。编号后采用随机数法抽样分为A组、B组和C组，每组8只。A组创建SAP模型后不给予 5-FU；B组创建SAP模型后经股静脉输注5-FU 10 mg/kg，采用0.1 mL肝素钠生理盐水封管，防止穿刺针内残留药物；C组创建SAP模型后于10倍手术显微镜指导下区域动脉灌注5-FU 10 mg/kg，主要自肝固有动脉插管，直至胰十二指肠动脉，经导管给药。术后缝合皮肤及皮下组织。

1.2.2血清淀粉酶、脂肪酶检测 给药后6 h股动脉采血，取血清标本，检测血清淀粉酶、脂肪酶等。

1.2.3胰腺HE染色 采用颈椎脱臼法处死大鼠，开腹取1.0 cm×1.0 cm胰腺组织，厚度尽量薄，以增大接触面积。标本固定于4%多聚甲醛中。用自来水洗涤10 min，脱水：75%乙醇持续1 h，85%乙醇持续1 h，95%乙醇持续1 h，95%乙醇持续1 h，无水乙醇持续30 min。透明：二甲苯Ⅰ持续30 min，二甲苯Ⅱ持续30 min，注意观察组织形态。常规浸蜡，包埋，置于-20 ℃冰箱内过夜。蜡块切片，厚度10 μm切齐整，4 μm细切。48 ℃捞片，置入68 ℃红烤箱持续2 h。合理控制烤片时间，防止烤片过短引发脱片，烤片过久致使脱蜡时间延长。常规脱蜡，苏木精染色10 min，用自来水洗涤10 min。观察充分返蓝后伊红染色25 s。中性树胶封片，显微镜下观察、拍片。采用原位末端标记法检测胰腺腺泡细胞凋亡率，严格按试剂盒说明书进行操作。阳性标准：细胞核内存在黄色颗粒。在光镜下计算胰腺腺泡细胞凋亡指数，计数高倍镜(400×)下500个细胞，计算凋亡细胞、总细胞数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4胰腺病理评分 取胰腺标本，石蜡切片，HE染色，参照文献[6]进行胰腺病理评分，由2名经验丰富的病理科医师采用双盲法评估，包括胰腺间质水肿、腺泡细胞坏死、炎症细胞浸润、出血、脂肪坏死等，各项由轻至重以0～4分表示。

2 结 果

2.1胰腺组织光镜观察 3组大鼠胰腺腺体结构均紊乱，部分腺泡组织空泡化，胰腺间质水肿，存在炎症细胞浸润。C组大鼠胰腺炎症细胞浸润、腺泡细胞空泡化、胰腺间质水肿明显较B组减轻。见图1。

短箭头：炎症细胞浸润；长箭头：胰腺腺泡细胞空泡化。

2.23组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平比较 B、C组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明显低于A组，且C组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明显低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平比较

2.33组大鼠胰腺细胞凋亡指数、胰腺病理评分比较 B、C组大鼠胰腺细胞凋亡指数、胰腺病理评分均明显低于A组，且C组大鼠胰腺细胞凋亡指数、胰腺病理评分均明显低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠胰腺细胞凋亡指数、胰腺病理评分比较

3 讨 论

当前，尚未具体明确急性胰腺炎的发病机制，考虑与肠道细菌易位、炎症、胰腺腺泡内钙超载、细胞凋亡等因素有关[7]。有研究表明，SAP的发生、发展与炎症应激关联较大。炎症应激还可造成患者自身组织、器官损伤，导致SAP患者出现免疫损伤，影响T淋巴细胞免疫功能。此外，有研究发现，在急性胰腺炎发生、发展中，胰腺腺泡细胞凋亡发挥了重要作用[8-9]。目前，区域动脉灌注作为SAP非手术治疗手段已用于临床，可经由区域动脉灌注给药方式促使胰腺组织药物浓度提升，增强疗效[10]。但就SAP区域动脉灌注药物的选择仍存在较大争议，而灌注药物组合方案选择对疗效具有直接影响。

有研究证实，5-FU可干扰DNA、RNA合成，控制胰腺腺泡细胞合成，抑制胰淀粉酶、胰蛋白酶的释放，还具有控制某些炎症介质的作用，减轻炎性反应[11]。李强等[12]研究表明，SAP大鼠经5-FU区域动脉灌注可减轻肺损伤，该作用机制与抑制促炎性细胞因子过度表达有关，但其未就胰腺细胞凋亡进行深入分析。本研究中B、C组分别采用5-FU外周静脉输注、区域动脉灌注途径给药，结果显示，B、C组大鼠胰腺细胞凋亡指数、胰腺病理评分均较A组低，差异均有统计学意义(P<0.05)。分析与5-FU本身作用机制有关，其可被细胞摄取，并进一步代谢成为几种活性代谢产物，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性，且能直接对DNA链延长产生作用，促使DNA稳定性出现变化，DNA断裂，抑制细胞凋亡，达到减轻胰腺炎症病理程度的目的。本研究结果还显示，与B组比较，C组大鼠胰腺细胞凋亡指数、胰腺病理评分均更低，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示5-FU区域动脉灌注途径给药在抑制胰腺细胞凋亡、控制病情方面的价值较5-FU外周静脉血管途径给药更佳。分析其原因，可能是因为5-FU区域动脉灌注可提升胰腺组织内5-FU药物浓度，促使药效的充分发挥，避免了出现外周静脉途径给药所致5-FU较难进入胰腺组织、全身体液免疫抑制等问题。叶乐驰等[13]创建了SAP大鼠模型，并实施5-FU区域动脉灌注，结果同样证实胰腺腺泡细胞凋亡被明显抑制，认为是改善急性胰腺炎的重要机制。此外，血清淀粉酶、脂肪酶与胰腺炎的发生关联较大[14-16]。血清淀粉酶主要分泌自唾液腺、胰腺等，可分解多糖，其检测指标在急性胰腺炎的诊疗中判断疾病严重程度方面发挥着重要作用。而脂肪酶为胰腺外分泌酶，正常时为消化酶的一种，进入主胰管流入十二指肠参与消化，但胰腺细胞被免疫因子破坏崩解后便释放入血，故血清脂肪酶水平取决于细胞崩解率，因此，检测脂肪酶水平可判断SAP患者的预后。本研究结果显示，B、C组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明显低于A组，且C组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明显低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，SAP大鼠模型经5-FU区域动脉灌注可明显抑制胰腺细胞凋亡，控制血清淀粉酶、脂肪酶水平，减轻病理改变程度，需引起高度关注。