产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

王 娜，李 慧，戴伶俐，孙学颖，靳 烨，赵丽华*

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018 2 内蒙古自治区农牧业科学院 呼和浩特010031）

随着居民生活水平的提高，人们的健康意识也逐渐提高，越来越重视食品安全问题。据美国疾病控制中心报道[1]：美国平均每年由食品腐败所导致的疾病案例大约7 600 万例，约5 000 人死亡，且大肠杆菌、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等食品腐败菌的广泛传播危害了人类健康。在食品工业生产中，常加入防腐剂抑制食品中腐败微生物的生长繁殖，以延长食品的保质期。然而，食品防腐剂是否安全与人体健康息息相关。食品防腐剂从来源上可分为合成防腐剂和天然防腐剂。合成防腐剂在规定的剂量范围内使用，对人体无任何危害，然而，有的食品企业为了延长保质期，存在过量添加防腐剂的问题，而长期过量摄取防腐剂对人体的危害极大。筛选天然、绿色防腐剂已成为国内外研究的热点。由于乳酸菌素是天然微生物防腐剂，其能抑制食品中的金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌等致病菌的生长繁殖，且不会影响食品品质，因此筛选产细菌素的乳酸菌，并大批量和产业化提取细菌素，对于防止食品腐败变质具有重要的意义，可能成为未来防腐剂的发展趋势。

乳酸菌素[2-5]是乳酸菌在生长代谢过程中产生的一类具有抗菌活性的肽或多肽物质，大部分细菌素的抑菌能力主要表现在近源菌，然而抑菌范围不仅仅限于相近的种，且产细菌素菌株本身具有免疫保护功能。1928年，Rogersl 等[6-7]发现Nisin，随后国内外的研究人员筛选产细菌素的乳酸菌，至今已筛选出70 多种乳酸菌素。大量的研究表明片球菌素具有稳定的理化特性，能抑制多种食源性致病菌的生长繁殖，尤其是单核增生李斯特菌[8]。目前，片球菌素已成为国内外的研究热点，如片球菌素PA-1[9]、片球菌素SM-1[10]、戊糖片球菌素PPK34[11]、戊糖片球菌素N463[12]、戊糖片球菌素L5-6[13]、乳酸片球菌素HA-6111-2、乳酸片球菌素HA-5692-3[14]和乳酸片球菌素HW01[15]等。本研究以大肠杆菌、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌为指示菌，从蒙古国风干牛肉中筛选具有抑菌活性的片球菌，研究该菌的抑菌特性，为开发安全、高效的食品生物防腐剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 乳酸菌：均分离自蒙古国戈壁省市售自然风干牛肉（2 份）；指示菌：大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、假单胞杆菌等均由内蒙古农业大学微生物实验室提供。

1.1.2 主要药品及试剂 MRS 肉汤、MRS 固体培养基、LB 肉汤、LB 固体培养基，广东环凯有限责任公司；细菌基因组提取试剂盒，天根生化有限责任公司。

1.1.3 仪器与设备 ZSB-1200IIA2 生物安全柜，南京博尔迪生物科技有限公司；PowerPac HC Power Supply 电泳仪、HE99X 电泳槽，美国伯乐公司；LRH-150 电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；KDC-140HR 高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 产细菌素乳酸菌的初筛 无菌称取25 g 风干牛肉，剪碎，置于225 mL 已灭菌的生理盐水中，即稀释度为10-1的样品液，继续10 倍递减稀释，分别吸取稀释液100 μL 涂布于MRS+0.7%碳酸钙固体培养基，37 ℃厌氧培养24 h，挑取有明显钙圈的菌落，并反复划线，直至得到纯菌株。

将乳酸菌活化2 代，用50 mL MRS 肉汤扩大培养24 h，将培养后的发酵液在4 ℃，8 000 r/min条件下离心10 min 留上清，然后用0.22 μm 水系滤菌器过滤菌株的杂质，得到发酵上清液，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌为指示菌进行牛津杯抑菌试验。

1.2.2 产细菌素乳酸菌的复筛

1.2.2.1 排除酸及酸性末端产物试验 将菌株发酵液用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 调节pH 值至5.0，用乳酸、盐酸、乙酸调节pH 值为5.0 的MRS 肉汤作对照组，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌为指示菌进行牛津杯抑菌试验。

1.2.2.2 排除过氧化氢试验 取排酸后仍能保持较强抑菌活性的菌株发酵液10 mL，并将pH 值调至7.0，然后加入10 mg 的过氧化氢酶，置于37 ℃的恒温水浴锅保温2 h，再将pH 值调至5.0，以未处理的发酵液作对照，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌为指示菌做牛津杯抑菌试验。

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1.2.2.3 蛋白酶敏感试验 将酸以及过氧化氢酶处理后仍能保持较强抑菌效果的菌株发酵液的pH 值调至胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最适pH 值（分别为7.4，7.4，6.0，2.0），使各酶的终质量浓度为1.0 mg/mL，37 ℃恒温水浴4 h，沸水5 min 使各酶的活性丧失，再将pH 值调为5.0，采用牛津杯法做抑菌试验，以未处理发酵液作对照[16]。

1.2.3 乳酸菌上清液中抑菌物质对温度及pH 的稳定性试验 将菌株上清液的pH 值调至5.0，分别进行如下处理：60，80，105 ℃条件下30 min 以及121 ℃条件下15 min，采用牛津杯法做抑菌试验。用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 将菌株上清液的pH 值调至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，采用牛津杯法做抑菌试验，同时以灭菌的MRS 肉汤作对照。

1.2.4 抑菌谱的测定 指示菌活化3 代并将菌浓度调至106CFU/mL，采用牛津杯法测定菌株发酵上清液对各指示菌的抑菌能力。

1.2.5 产细菌素乳酸菌鉴定

1.2.5.1 表型鉴定 通过个体形态特征、菌落形态特征和液体形态特征等指标进行乳酸菌表型鉴定。

1.2.5.2 生理生化鉴定 参考文献[17]，通过温度试验，V-P 试验，产硫化氢试验，运动性以及糖发酵等试验进行乳酸菌生理生化鉴定。

1.2.5.3 16S rDNA 鉴定 使用细菌基因组提取试剂盒提取乳酸菌DNA，PCR 扩增以27F 和1492R 为引物。引物的合成和扩增产物的测序均由上海生工生物有限责任公司完成。PCR 反应条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，90 s，30 次循环；72 ℃，7 min。

利用NCBI 工作站进行序列比对，利用软件MegAlign 构建菌株系统发育树。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的初筛

由表1可知，菌株37X-3 和37X-13 对3 种指示菌的抑菌活性最高，因此选择这2 株菌株进行复筛试验。

表1 产细菌素乳酸菌的初筛结果Table 1 Preliminary results of bacterioncin producing by latic acid bacteria

2.2 产细菌素乳酸菌的复筛

2.2.1 菌株发酵上清液排酸试验 由表2可知，当pH 5 时，菌株发酵上清液对3 种指示菌均有较强的抑制效果，且对单核增生李斯特菌CMCC54001 抑制效果最强；但用乳酸、乙酸、盐酸分别调节MRS 肉汤的pH 值为5.0 时，均不能抑制3种指示菌生长繁殖。由此可以说明，菌株发酵上清液对3 种指示菌所表现的抑菌作用，不是酸作用的结果，可能是其它物质作用的结果，需进行大量的试验验证。

表2 菌株发酵上清液排酸试验Table 2 Test of organic acid eliminnation of strain fermentation supernatant

2.2.2 菌株发酵上清液排除过氧化氢试验 由表3可知，经过氧化氢酶处理的发酵液与未经处理发酵液相比抑菌能力几乎没有下降，因此可以说明过氧化氢不是引起抑菌的物质，可能有其它具有抑菌能力的物质存在。

2.2.3 菌株发酵上清液对酶敏感试验 初筛的两菌株经各蛋白酶处理后，对指示菌的抑菌能力均表现降低的趋势，甚至出现丧失的现象，由此可以证明发酵上清液中存在的抑菌活性物质是细菌素。

表3 菌株发酵上清液排除过氧化氢试验Table 3 Test of hydrogen peroxide eliminnation of strain fermentation supernatant

表4 菌株发酵上清液对酶敏感试验Table 4 Sensitivity test of strain fermentation supernatant on protease

2.3 菌株发酵上清液对热及pH 稳定性试验

由图1可知，随温度的升高，戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 对3 种指示菌的抑菌能力逐渐降低，经80 ℃处理30 min，对3 种指示菌的抑菌能力较强；经105 ℃处理30 min 后，抑菌能力有所降低；经121 ℃处理15 min 后，对3种指示菌的抑菌活性仍能保持70%，表明这2 种乳酸菌素对热不敏感。

由图2可知，在pH 值为2～6 时，戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 对3 种指示菌均具有抑菌活性，随pH 值的升高，对3 种指示菌的抑菌能力逐渐降低，说明这2 种乳酸菌素在低酸体系下活性较强。

2.4 抑菌谱

由表5可知，戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 能抑制枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、巴黎链球菌等革兰氏阳性菌及沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌，具有广谱抑菌活性。

图1 菌株发酵上清液对热稳定性试验Fig.1 Stability test of strain fermentation supernatant on thermal

2.4.1 产细菌素乳酸菌的表型鉴定 挑取有明显钙圈的菌落进行革兰氏染色，油镜下观察发现菌体呈圆球形，对生排列。

在MRS+0.7%无菌碳酸钙固体培养基中于30℃厌氧培养48 h 后，菌落表面光滑湿润呈乳白色，菌落形态大致呈圆形或椭圆形，直径约为1～2 mm，并且菌落周围有明显的透明圈。

在30 ℃的条件下培养24 h 后，MRS 液体培养基达到浑浊状态，菌体呈白色并沉淀到MRS 液体培养基底部。

表5 乳酸菌素的抑菌谱Table 5 Antibacterial spectrum of lactic acid bacteriocin

2.4.2 菌株生理生化鉴定 菌株37X-3 在45 ℃下能生长，对鼠李糖、麦芽糖、核糖、阿拉伯糖、海藻糖具有发酵作用，初步判定为戊糖片球菌。菌株37X-13 在45 ℃下能生长，对核糖和木糖具有发酵作用，初步判定为乳酸片球菌。

图2 菌株发酵上清液对pH 稳定性试验Fig.2 Stability test of strain fermentation supernatant on pH

图3 菌株菌体形态特征Fig.3 The morphological features of strains

表6 菌株37X-3 和37X-13 生理生化鉴定Table 6 Identification of physiology and biochemical for strain 37X-3 and 37X-13

2.4.3 菌株16S rDNA 鉴定 菌种16S rDNA 序列分析表明37X-3 的DNA 基因序列共1 452 bp，37X-13 的DNA 基因序列共1 539 bp，经BLAST分析，结果见图4，37X-3 与戊糖片球菌MH111691.1 （Pediococcus pentosaceus MH111691.1）的相似度达到99.2%，37X-13 与乳酸片球菌EF059987（Pediococcus acidilatici EF059987）的相似度达到99.9%，因此鉴定37X-3 为戊糖片球菌，37X-13 为乳酸片球菌。

图4 37X-3 和37X-13 的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree analysis of strain 37X-3 and 37X-13

图5 37X-3 和37X-13 的序列同源性分析Fig.5 Sequence homology analysis of strain 37X-3 and 37X-13

3 结果与讨论

3.1 乳酸菌素筛选及鉴定

乳酸菌可以产生多种抗菌活性成分，但逐一排除难度非常大。张红星等[12]通过乳酸菌排酸试验、过氧化氢酶试验、酶敏感试验，认为上清液中有蛋白类物质的存在，即为细菌素。由于本试验菌株37X-3 和37X-13 的上清液在酸及过氧化氢酶处理后，仍能保持较强的抗菌活性，且对各类蛋白酶敏感，因此认为菌株37X-3 和37X-13 的上清液中存在细菌素物质。

生理生化的方法存在许多缺陷，试验结果并不能准确地反映菌株的种属，应将表型鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA 鉴定相结合，使结果更加准确。马迎涛[16]将以上3 种方法结合起来鉴定菌株S2 为副干酪乳杆菌，本试验菌株37X-3 和37X-13 分别经以上3 种方法鉴定为戊糖片球菌和乳酸片球菌。

3.2 乳酸菌素对热及pH 值稳定性

本研究中具有抗菌效果的戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 在酸性体系中能保持较强的抗菌能力，随pH 值的升高抗菌能力减弱，如Nisin 在pH 值为6 的体系中仅残留10%的抗菌活性，这与大部分乳酸菌素的特性相似。由此可知，2 株片球菌素可作为酸性或中性防腐剂。Jack 等[18]的研究表明，乳酸菌素在高pH 值的体系中抗菌能力减弱甚至丧失，可能是由于高pH 值体系会改变乳酸菌素的分子蛋白结构。Zacharof 等[19]的研究表明，乳酸菌素在弱酸体系中更有利于蛋白类物质吸附于靶细胞上，有利于发挥抗菌作用。

对热稳定是乳酸菌素的一大优势，目前大多数乳酸菌素经高温处理后仍能保持较强的抗菌能力。乳酸菌素的热稳定性与其纯度、酸碱性等有密切关系。65～80 ℃为巴氏杀菌的温度，而121 ℃为微生物灭菌的温度。该试验中的2 株片球菌素在pH 值为5 时，经65，80，121 ℃处理后对3 种指示菌均表现出较强的抑菌效果，故这2 株片球菌素在需热处理的食品中有潜在的应用价值。

4 结论

本试验以蒙古国风干牛肉为样品，通过平板划线法分离出28 株乳酸菌。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌为指示菌检测28株乳酸菌的抑菌活性，经排除酸和过氧化氢酶以及酶敏感试验，从中选取2 株抑菌能力最强的乳酸菌，经表型、生理生化和基因型鉴定，确定菌株37X-3 为戊糖片球菌，菌株37X-13 为乳酸片球菌。

2 种片球菌素在121 ℃，15 min，pH 值为2～6范围内能抑制3 种指示菌的生长，且对单核李斯特菌抑菌作用最强。2 种片球菌素均能抑制枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌等革兰氏阳性菌及沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌，具有广谱抑菌活性。