负载生育酚的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的构建及性质表征

许雪儿，李 娟，陈正行*

（1 盐城工业职业技术学院药品与健康学院 江苏盐城224005 2 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室 江苏无锡214122）

生育酚作为维生素E 的水解产物，是一类天然的、脂溶性抗氧化剂。近年来因其较强的抗氧化性，故被广泛运用在婴儿食品、强化食品等产品中。然而，其水不溶性及对光、热不稳定等因素[1]往往影响其应用。本文拟通过构建复合阿拉伯胶的玉米醇溶蛋白纳米颗粒运载体系，对生育酚进行高效负载以提高其生物利用率。玉米醇溶蛋白（zein）作为一类两亲性的生物大分子物质，占据了玉米蛋白含量的60%[2]。玉米作为我国年产量较高的粮食作物，除了满足日常饮食需要外，20%的玉米常用以制备玉米淀粉，因此在玉米淀粉的分离产物中，玉米蛋白的产量也相对较大，因蛋白质组成和配比不符合人体必需氨基酸的需求而不被重视与利用[3]。zein 含有较多的疏水氨基酸，缺乏带电的酸性氨基酸和碱性氨基酸。zein 独特的氨基酸构成也直接影响其溶解性，zein 不能溶解于水和无水乙醇中，只能溶于35%～90%乙醇[4]。其独特的两亲性、成膜性以及凝胶性等性能使得zein 在纳米颗粒等运载体系中应用广泛，而其水不溶性和不稳定性限制了在生物大分子运载体系中的应用[3]。阿拉伯胶（Arabic gum，AG）作为一类天然的阴离子多糖，分子链上的蛋白质和鼠李糖使得AG具有良好的亲水亲油性，此外通过AG 与zein 的结合可提高zein 纳米颗粒的水溶解性，还能保护生育酚不被胃部环境消化，在肠部得到有效降解[5]。王丽娟[6]通过制备果胶-zein 纳米颗粒运载体系负载姜黄素。尹业充[7]通过制备负载百里香酚的zein 纳米颗粒以提高百里香酚负载率的同时，达到抑菌作用。

本文通过反溶剂法制备zein/AG-TOC 的纳米颗粒，研究不同zein∶GA 比例，不同搅拌速度对zein-AG 纳米颗粒稳定性的影响；分析不同pH值，不同盐离子浓度对负载TOC 的zein-AG 纳米颗粒稳定性的影响，以及对zein/AG-TOC 纳米颗粒的抗氧化性和胃肠道缓释能力进行研究，为探究zein/AG 纳米颗粒负载疏水性营养物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白，河南华瑞生物科技有限公司；阿拉伯胶、α-生育酚，美国sigma 试剂公司；氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、石油醚等试剂均为分析纯级，上海国药集团。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器，IKA 仪器公司；CR21G 型冷冻干燥机，日本日立公司；Zetasizer Nano 纳米粒度及电位测定仪，英国马尔文仪器公司；WFZ UV-2000 型紫外分光光度计，上海尤尼柯有限公司；LXJ-IIB 型台式离心机，上海安亭仪器厂；DHG-9101o3SA 型恒温干燥箱，上海三发仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 纳米颗粒制备 首先制备含zein 的乙醇溶液：称量0.5 g zein 至10 mL 体积分数为80%的乙醇溶液中，并将含zein 的乙醇溶液置于磁力搅拌器上以200 r/min 的速度搅拌30 min 备用；其次，制备AG 的水溶液：称量2 g AG 置于去离子水中并置于磁力搅拌器上以200 r/min 的速度搅拌1 h备用；最后开始制备纳米颗粒：移取一定量的含zein 的乙醇溶液快速滴至体积为38.9 mL 的蒸馏水中得到zein 纳米颗粒，然后按照不同zein∶AG比例移取不同体积的AG 水溶液至zein 纳米颗粒中，分别置于磁力搅拌器上搅拌60 min 后，以4 000 r/min 的转速离心10 min 后，其上清液即为zein-AG 复合纳米颗粒[8]。

1.3.2 不同zein∶AG 比例下纳米颗粒粒径、电位、多分散指数（Polydispersity index，PDI）测定 移取800 μL 含zein 的乙醇溶液快速滴至体积为38.9 mL 的蒸馏水中得到zein 纳米颗粒，然后按照不同zein∶AG（20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶5）比例移取不同体积的AG 水溶液至zein 纳米颗粒中，置于磁力搅拌器上搅拌60 min 后，以4 000/min 的转速离心10 min 后，其上清液即为zein-AG 复合纳米颗粒。将所得到的zein-AG 复合纳米颗粒用去离子水稀释10 倍，于涡旋振荡器上涡旋1 min 待分散均匀后，移取1 mL 稀释后的样品放入纳米粒度电位仪的样品池中进行测定[9]。

1.3.3 不同搅拌速度下纳米颗粒粒径、电位、PDI测定 在纳米颗粒的制备过程中以不同的搅拌速度（300，400，500，600，700，800，900，1 000，1 100，1 200，1 300 r/min）制备纳米颗粒，其它步骤同1.3.1 节（固定zein∶AG=1∶1.5）。

1.3.4 负载TOC 的纳米颗粒制备 按照zein-AG∶TOC 为1∶5 在1.3.2 节中制备所得的含zein的乙醇溶液中移入TOC，得到负载TOC 的含zein的乙醇溶液；随后移取800 μL 负载TOC 的含zein的乙醇溶液，按照1.3.2 节的后续步骤制备得到zein/AG-TOC 复合纳米颗粒。

1.3.5 pH 值对zein/AG-TOC 纳米颗粒稳定性的影响 用pH 值范围在3～9 的磷酸盐缓冲溶液调节纳米颗粒的pH 值为3～9，随后分别取1 mL pH=3～9 的zein/AG-TOC 复合纳米颗粒并稀释10倍，在涡旋振荡器上分散均匀后移取1 mL 不同pH 值的纳米颗粒放入样品池后测定其粒径、电位和PDI。

1.3.6 不同盐离子浓度下纳米颗粒粒径、电位、PDI 测定 分别取10 mL zein/AG-TOC 复合纳米颗粒置于50 mL 的离心管，随后，每管分别加入10 mL 浓度为0～100 mmol/L 的NaCl 溶液，使得盐溶液能够充分混合纳米颗粒，并于室温下静置30 min。移取1 mL 不同盐离子浓度破坏的zein/AGTOC 复合纳米颗粒并将其稀释至10 倍，振荡均匀后移取1 mL 置于样品池中待测。

1.3.7 zein/AG-TOC 复合纳米颗粒抗氧化性的测定 参照任晓鸣[10]的方法对zein-AG 纳米颗粒和zein/AG-TOC 复合纳米颗粒的抗氧化性（对DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力以及ABTS清除能力）进行测定，取1 mL zein/AG-TOC 复合纳米颗粒分别与相应溶液混合后于分光光度计下进行吸光值测定，并对测定结果进行相应计算。

1.3.8 zein/AG-TOC 复合纳米颗粒模拟胃肠道消化反应 对zein/AG-TOC 复合纳米颗粒根据王涛[11]的方法进行模拟胃肠道消化的反应。先进行模拟胃部消化环境，移取50 mL 新鲜制备所得的zein/AG-TOC 复合纳米颗粒置于离心管中，并用1 mol/L 的HCl 溶液调节待消化样品的pH 值至2.0，随后添加胃蛋白酶（20 mL，18 mg/L）并置于水浴摇床中在37 ℃的条件下进行胃部模拟消化反应，消化时间共计120 min。同时，先后在10，20，30，45，60，75，90，105，120 min 的时间节点移取一定量体积的胃部消化液对其TOC 含量进行测定。胃部模拟消化结束后，用1 mol/L 的NaOH 溶液将经过120 min 胃部消化后的消化液的pH 值调节至7.0，并加入0.06 g 胰蛋白酶以模拟肠道消化环境，肠部消化时间为120 min。先后在肠部模拟消化时间为10，20，30，45，60，75，90，105，120 min时移取一定量的肠部消化液测定其TOC 含量。消化液中的TOC 的具体测定步骤为：移取定量体积的待测胃、肠部消化液与2 mL 的乙酸乙酯于涡旋振荡器中分散均匀，以充分提取待测样液中的TOC，随后取上清液的有机相置于276 nm 波长下的紫外分光光度计进行吸光度的测定，将测定所得吸光值代入标准曲线计算待测消化液中释放的生育酚的浓度。按照以下公式对模拟胃肠道消化所得的待测液中生育酚的释放速率进行测定，并进行生育酚的胃肠部释放动力学的线性拟合。

2 结果与分析

2.1 zein∶AG 比例对zein-AG 复合纳米颗 粒的粒径、PDI、电位值的影响

从图1a 中可以看出，当AG 含量增大时，zein-AG 复合纳米颗粒的粒径随之呈现先变小后逐渐于稳定的趋势。当AG 添加量为zein∶AG=20∶1 时，纳米颗粒不稳定，粒径为微米级，PDI 为1，表明此时体系中的桥状絮凝较严重，未有纳米颗粒形成；当AG 添加量为zein∶AG=10∶1 时，桥状絮凝现象减弱，且体系中逐渐形成纳米颗粒，但体系仍不稳定；因此，这两个比例下纳米颗粒的粒径等数据均未显示在图1中。当AG 添加量达到zein∶AG=5∶1 时，体系中纳米颗粒出现，并呈现乳光特性，粒径达到纳米级，PDI 也小于0.5。直到体系中AG 的添加量达到zein∶AG=1∶1.5 时，纳米颗粒粒径体系稳定，粒径、PDI 无显著变化，此时，再增大AG 的量对于体系稳定性均无显著影响。因此，从节约成本及体系稳定的角度来看，zein∶AG比例在1∶1.5 时为最优的复合纳米颗粒配比。这可能是由于AG 的量不足以稳定zein 纳米颗粒时，AG 分子的加入破坏了zein 分子间的稳定，并在分子间形成絮凝结构，当AG 分子足够稳定zein分子时，两者通过分子间相互作用形成复合纳米颗粒，既稳定了zein 分子，也有利于体系的稳定性。该试验结果与黄晓霞[12]研究zein 复合果胶形成的纳米颗粒所形成的结果相一致。

图1 不同zein∶AG 比例下zein-AG 纳米颗粒粒径、PDI（a）、电位（b）图Fig.1 The effect of the different ratios of zein∶AG in the particle size，PDI （a），zeta-potential （b）of the zein-AG nanoparticles

2.2 搅拌速度对zein-AG 纳米颗粒的粒径、PDI、电位值的影响

如图2所示，搅拌速度小于400 r/min 时，体系较稳定，但形成的纳米颗粒粒径较大，且PDI 值较大，表明搅拌速度不足以形成足够稳定的纳米颗粒体系；当搅拌速度达到800 r/min 时，体系纳米颗粒粒径最低，PDI 值最小，电位也最稳定；当搅拌速度提高至1 300 r/min 时，体系再次趋于不稳定，且zein 出现聚集现象，原因可能是较快的搅拌速度来不及形成稳定的复合纳米颗粒，而剪切力直接破坏了zein 纳米颗粒的稳定性，使得分子之间严重絮凝结块，无法生成稳定的纳米体系。因此，在制备复合纳米颗粒时，选择搅拌速度800 r/min 为最适纳米颗粒的形成速度。Gagliardi 等[13]在研究zein 基纳米颗粒的形成时也表明，搅拌速度对体系造成的剪切力会直接影响纳米颗粒的形成状态，故应合理设置搅拌速度以保证体系纳米颗粒的完全形成。

图2 不同搅拌速度对zein-AG 复合纳米颗粒的粒径的影响Fig.2 The effect of the strring speed in the particle size of the zein-AG nanoparticles

2.3 pH 值对zein/AG-TOC 复合纳米颗粒粒径、PDI、电位值的影响

通过图3a 的粒径图可以看出，zein/AG-TOC复合纳米颗粒在不同pH 值的影响下粒径和PDI值无显著变化，表明复合纳米颗粒对pH 值在3～9的耐受性较好，原因推测为AG 复合了zein 纳米颗粒，保护了单纯的zein 纳米颗粒不被过酸或过碱环境破坏，进而影响纳米颗粒体系的稳定。从图3b 的电位图可得，zein-AG 复合纳米颗粒在pH=3的条件下其电位较低，体系不稳定，这可能是由于体系的pH 值接近AG 的pKa 值2.3，此时，AG 的带电量较少，破坏体系稳定性；而pH=4～9 的范围内复合纳米颗粒的电位均较为稳定。该试验结果说明，AG 与zein 的结合改善了zein 在等电点附近的聚集情况。刘贵金、牛付阁等[14-15]在研究zein基纳米颗粒的制备时均有相同结论。

图3 pH 值对zein/AG-TOC 纳米颗粒粒径、PDI、电位的影响Fig.3 The effects of pH in the particle size，PDI and zeta-potential of the zein/AG-TOC nanoparticles

2.4 不同盐离子浓度对zein/AG-TOC 复合纳米颗粒粒径、PDI、电位值的影响

盐离子浓度对zein/AG-TOC 复合纳米颗粒的粒径、PDI、电位的影响如表1所示，当盐离子浓度小于20 mmol/L 时，体系的粒径为纳米级，PDI 也较为稳定，而当盐离子浓度提高至30～50 mmol/L时，纳米颗粒的粒径增大至微米级，体系出现明显絮凝物，且PDI 为1；电位也接近于-5 mV；同时，纳米颗粒的粒径、PDI、电位也均随着盐离子浓度的增大而增大，即表明体系变得不稳定。该结果表明，zein/AG-TOC 复合纳米颗粒能够承受的盐离子浓度为20 mmol/L，原因可能是由于AG 与zein之间以分子间相互作用力结合成稳定的复合物[17]，而20 mmol/L 浓度的盐离子不足以破坏zein与AG 之间的相互作用力，当盐离子浓度大于20 mmol/L 时，体系发生电荷屏蔽作用，颗粒发生絮凝而显示为粒径变大、电位变大。该试验结果与Dai 等[16]在研究盐离子对纳米颗粒的干扰作用时的结果相同。

表1 盐离子浓度对纳米颗粒粒径、PDI、电位的影响Table 1 The effects of the concentrations of salt in the particlesize，PDI，zeta-potential of the zein/AG-TOC nanoparticles

2.5 zein/AG-TOC 纳米颗粒的抗氧化性

如图4所示，是zein/AG-TOC 复合纳米颗粒的抗氧化性，包括对于DPPH、ABTS、超氧阴离子的清除能力。图中可以看出，zein/AG-TOC 复合纳米颗粒中的TOC 能够被释放游离出来，并对于这3 种物质均呈现出一定的抗氧化性。黄旭琳等[17]在研究负载姜黄素的zein 基纳米颗粒时也发现制备得到的复合纳米颗粒具备一定对DPPH 的清除能力；同样黎亢抗[18]在制备负载百里香酚的纳米颗粒时，对大肠杆菌也具有一定的抑菌性能。该结论能够证明，TOC 能够较好地被负载在zein/AG 的复合纳米颗粒中，并达到一定的抗氧化性能。

2.6 zein/AG-TOC 纳米颗粒的模拟胃肠道消化情况

图4 zein/AG-TOC 复合纳米颗粒的抗氧化性图Fig.4 The antioxidant properties of zein/AG-TOC composite nanoparticles

图5 zein/GA-TOC 纳米颗粒中生育酚的模拟胃肠道释放动力学曲线图Fig.5 Simulated gastrointestinal tract release kinetics of tocopherol in zein/GA-TOC nanoparticles

从图5可以看出，zein/AG-TOC 纳米颗粒在模拟胃肠道环境中的消化情况。其中，模拟胃部环境时，前30 min 内TOC 的释放率明显较大即发生了突释现象，表明此时纳米颗粒运载体系破裂，TOC 快速游离出来，增大了释放率；而随着时间的推移，在胃部消化的后90 min 内，TOC 的释放率显著减小并趋于平缓，且当胃部消化结束后，释放率为46.8%。采用一级动力学模型对胃部消化环境进行模拟和线性拟合，试验结果显示TOC 的释放趋势符合一级动力学，且R2为0.915。此外，该结果还可以推测出AG 的结合能够有效阻止zein被胃部环境的破坏，使得纳米颗粒具备胃蛋白酶消化抗性，同时也说明复合纳米颗粒的机械强度和致密度较高[19-20]。在模拟肠部消化环境中，随着肠部消化时间的推移，TOC 从纳米颗粒中的释放速率逐渐增大，直到胃肠道消化达到240 min 时，TOC 的释放率接近100%，该结果推测是因为肠部模拟环境的pH 值为7，在该条件下复合纳米颗粒易被胰蛋白酶消化而释放出TOC，实现人体结肠部位的靶向释放[11]。综上所述，zein/AG-TOC 纳米颗粒能够较好地保护TOC，并在人体胃肠部实现缓释。

3 结论

本文通过对zein 与AG 的比例、搅拌速度等zein-AG 纳米颗粒制备过程的工艺条件进行研究；同时，探讨负载TOC 的复合纳米颗粒在不同pH 值和盐离子浓度下的稳定性情况，表明zein/AG-TOC 复合纳米颗粒具备一定的抗酸碱性和盐离子耐受性，能够较好地运载TOC，且具有较高的抗氧化性；此外，胃肠道缓释结果也表明AG 的结合能够较好地保护zein 基纳米颗粒达到胃肠道缓释的作用，在提高了TOC 生物利用率的同时，拓展了zein 的应用。因此，本试验可说明zein-AG 复合纳米颗粒可作为运载体系对TOC 进行运载，并可考虑作为更多疏水性营养物质的运载壁材，以拓宽zein 的生物利用范围。