植物乳杆菌DL3对腐败希瓦氏菌的抑制作用

2021-01-15刘佳伊吕欣然白凤翎励建荣

中国食品学报 2020年12期

刘佳伊，吕欣然，李婧，白凤翎*，董君，励建荣

（1 渤海大学食品科学与工程学院辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013 2 宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心银川750000）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生以乳酸为主要产物的无芽孢革兰氏阳性细菌。乳酸菌栖息在传统发酵蔬菜、肉制品、乳制品、动物肠道、饲料等各种自然生态环境中，形成优势乳酸菌后对其它微生物类群具有较强的拮抗作用。乳酸菌主要通过产生有机酸、乳酸菌素、罗伊菌素、过氧化氢等代谢产物抑制其它微生物的生长繁殖[1-2]。乳酸菌种类的多样性决定了其拮抗机制的复杂性，主要包括乳酸菌的代谢产物攻击受试对象的细胞膜，干扰受试菌的细胞代谢活性，抑制蛋白质的合成等途径[3-6]。

目前，乳酸菌素Nisin 的抑菌机制的研究较清晰，Nisin 的抑制对象主要是革兰氏阳性菌，其可吸附在受试菌细胞壁合成的前体物质——脂质（lipid）II 上，进而抑制细胞壁的合成。此外，Nisin可插入受试菌的细胞膜上，导致孔的形成，打破细胞膜内、外原有的离子梯度平衡，从而使细胞内的氨基酸、K+、ATP 等物质外泄[7]。Avitabile 等[8]利用圆二色光谱技术（Circular dichroism，CD）发现蛙皮素和天蚕素A 两种抗菌肽通过与指示菌膜上的LPS 结合实现对大肠杆菌的抑制作用；Gupta 等[9-10]发现从面糊中分离的海氏肠球菌（Enterococcus hirae）形成的肠球菌素LD3 能够使沙门氏菌、志贺氏菌等受体细胞形成孔洞，促使ATP 外泄和质子电动势损耗，导致受试菌死亡；Zhao 等[11]发现从酸菜中筛选出的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JLA-9 通过抑制菌体细胞氧化呼吸代谢活动来阻碍蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的生长。但关于乳酸菌素抑制革兰氏阴性菌的作用机制还未完全阐述清楚，需要进一步的探究。

本文以产细菌素DL3 的植物乳杆菌DL3 为应试菌，腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）为受试菌，从生长曲线、细胞膜通透性、紫外吸收物质、细胞形态特征和蛋白质合成等指标探究植物乳杆菌DL3 对腐败希瓦氏菌的抑菌机理，以期为开发新的水产品生物防腐剂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与菌株应试菌：植物乳杆菌DL3，分离自东北传统发酵酸菜，经生理生化和16S rRNA鉴定，本校微生物学与分子生物学研究室保藏。受试菌：腐败希瓦氏菌ATCC8071，上海北诺生物科技有限公司。

1.1.2 试剂与培养基 LB 肉汤、MRS 培养基、LB营养琼脂，北京奥博星生物技术有限公司；乳酸菌生化鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，华蓝化学有限公司；α-氰基-4-羟肉桂酸HCCA，上海恒远生物科技有限公司；DNA marker-D、细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、Taq PCR Master mix、SDS-PAGE 蛋白质电泳所用试剂、蛋白质分子质量标准Marker，上海生工生物工程有限公司；乙酸乙酯、石油醚（AR），天津市富宇精细化工有限公司；Quantity one 凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；GENMED 细菌可溶性总蛋白质制备试剂盒，广州晨展贸易有限公司。

1.1.3 设备与仪器 GI54DS 立式高压蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；DL-CJ-2N 型超级洁净工作台，东联哈尔（北京）仪器制造有限公司；赛福智能生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；5804R 冷冻高速离心机、Mastercycler pro 梯度PCR 仪，德国Eppendorf 公司；DYY-8C 电泳仪，北京市六一仪器厂；Cheimdox XRS 凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司；UV2550-可见分光光度计，日本Shimadzu 公司；Labconco FreeZone 2.5 台式真空冷冻干燥机，美国LABCONCO 公司；Labscale TFF System 小型切向流超滤系统，美国Millipore 公司；Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；MALDI-TOF-TOF 质谱仪，上海一恒科学仪器有限公司；S-4800 扫描电镜，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌上清液（Cell free supernatant，CFS）的制备参照文献[12]的方法并稍作修改，将-80℃保存的菌株DL3 在MRS 液体培养基中于37 ℃条件下培养12 h，活化2 代。将活化的应试菌（植物乳杆菌DL3）接种在MRS 液体培养基中，于37℃条件下培养24 h 后于4 ℃，10 000 r/min 离心10 min，取上清液经过滤获得菌株DL3 CFS。取应试菌CFS 经-40 ℃真空冷冻干燥4 d，获得冻干粉进行下一步抑菌机理研究。

1.2.2 受试菌最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）测定采用液体二倍稀释法[13]，用LB 液体培养基将CFS 制成终质量浓度分别为32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125 mg/mL 的溶液，各取5.0 mL 为试验组，以LB 培养基为对照组。接种200 μL 1.0×106CFU/mL 受试菌（腐败希瓦氏菌）菌悬液，于30 ℃，150 r/min 条件下培养24 h，以未浑浊的最低质量浓度为受试菌的最小抑菌浓度，每组重复3 次。

1.2.3 受试菌生长曲线测定参考Saraoui 等[14]的方法稍作修改，将200 mL 1.0×106CFU/mL 受试菌菌悬液于30 ℃，150 r/min 条件下培养6 h，添加应试菌CFS 使其终质量浓度为0.5MIC，每隔2 h测OD600nm值，同时采用平板计数法进行活菌计数。

1.2.4 受试菌细胞膜通透性分析参考Shen等[15]的方法稍作修改。通过电导率的变化分析应试菌对受试菌细胞膜通透性的影响。在1.0×106CFU/mL 受试菌菌液中加入应试菌CFS，终质量浓度为0.5 MIC。于37 ℃条件下静置培养，每2 h 测定受试菌的电导率。

1.2.5 受试菌细胞外紫外吸收物质含量检测参考Lv 等[16]的方法稍作修改，在1.0×106CFU/mL 的受试菌菌悬液中，加入应试菌CFS 使其终质量浓度为0.5MIC，30 ℃，150 r/min 培养，每2 h 测OD260nm值。

1.2.6 受试菌蛋白质合成的分析

1.2.6.1 总蛋白质的提取参考Bradford[17]的方法稍作修改，用LB 液体培养基稀释获得1.0×106CFU/mL 受试菌菌悬液，加入应试菌CFS 使其终质量浓度为0.5MIC，于30 ℃，150 r/min 条件下培养12 h，离心（6 000 r/min，10 min）得菌体细胞，用0.1 mol/L pH 7.4 PBS 洗涤3 次。采用GENME 细菌可溶性总蛋白质制备试剂盒提取菌蛋白。

1.2.6.2 SDS-PAGE 分析取适量提取的菌蛋白与样品缓冲液混合，煮沸3 min，冷却至室温，上样量10 μL。电泳方法参考文献[18]并稍作改进：分离胶10%，浓缩胶4%，浓缩胶电压为80 mV，分离胶电压120 mV。电泳结束后用将整块胶在染色液（0.25%考马斯亮蓝G250）中摇床染色40 min，并在脱色液（V甲醇∶V冰醋酸∶V蒸馏水=25∶10∶65）中脱色，直至蛋白质条带清晰可见。电泳结果采用Quantity One 系统拍照。

1.2.7 扫描电镜观察参考Hovnanyan 等[19]的方法并稍作修改。以添加0.5MIC 应试菌CFS 为处理组，以添加等体积MRS 液体培养基为对照组。各取0.5 MIC 应试菌 CFS 和LB 培养基5.0 mL 后，分别加入200 μL 1.0×106CFU/mL 受试菌菌悬液，于30 ℃，150 r/min 条件下培养12 h，离心（6 000 r/min，10 min）收集菌体。在4 ℃，2.5%戊二醛溶液中固定12 h，用无菌水洗涤3 次，除去残留戊二醛，菌体再用无菌水悬浮。取适量菌体细胞滴于洁净盖玻片上，真空干燥12 h，喷金，扫描电镜观察。

2 结果与讨论

2.1 受试菌MIC 测定结果

经肉眼观察，当应试菌CFS 质量浓度达到和超过8.0 mg/mL 时，受试菌均无浑浊现象，确定应试菌CFS 对受试菌的MIC 为8.0 mg/mL。Yi 等[20]发现，从浆水中分离获得的棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）XN8 产生的乳杆菌素XN8-A 对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的MIC 均为6.85 mg/mL，与本试验的研究结果相似。

2.2 应试菌CFS 对受试菌生长曲线的影响

应试菌CFS 对受试菌生长曲线的影响如图1所示，与对照组相比，加入应试菌CFS 的受试菌生长曲线出现增长缓慢，稳定期延迟等现象，受试菌稳定期的细胞增长量仅为对照组的二分之一，说明应试菌CFS 能抑制受试菌的生长繁殖。与对照组相比，受试菌细胞数下降了1.16 lg（CFU/mL），结果表明植物乳杆菌对腐败希瓦氏菌生长具有抑制作用。Zouhaier 等[21]研究表明在伊氏利斯特菌（Listeria ivanovii）BUG496 对数生长期时加入不同浓度的肠球菌素MMZ17，伊氏利斯特菌BUG496 生长受到抑制，增加肠球菌素后伊氏利斯特菌BUG496 呈稳定生长趋势，细胞量仅为对数生长期的四分之一，与本试验研究结果相似。

2.3 应试菌CFS 对受试菌细胞膜通透性的影响

分析细菌细胞膜通透性变化是了解抑菌机理的途径之一。正常情况下，细菌的细胞膜具有一定的通透性。当细胞膜遭到破坏时，其通透性发生改变，内部的电解质（K+，Ca2+，Mg2+等）大量外渗至培养液中，细菌菌悬液中电导率的变化可以反映细菌细胞膜通透性的变化情况[16]。

应试菌CFS 对受试菌电导率的影响如图2所示，随着时间的延长，20 h 时试验组的电导率为34.3 ms/cm，对照组为33.1 ms/cm，试验组明显高于对照组。说明植物乳杆菌DL3 对腐败希瓦氏菌细胞膜具有攻击作用，导致细胞质渗漏。赵瑞香等[22]研究表明乳酸杆菌素H2 可引起大肠杆菌菌体细胞膜通透性增大，K+大量外泄导致膜电位消散，与本试验结果相似。

图1 植物乳杆菌DL3 CFS 对腐败希瓦氏菌生长曲线的影响Fig.1 Effects of L.plantarum DL3 CFS on the growth curves of S.putrefaciens

图2 植物乳杆菌DL3 CFS 对腐败希瓦氏菌电导率的影响Fig.2 Effects of L.plantarum DL3 CFS on the conductivity of S.putrefaciens

2.4 应试菌CFS 对受试菌紫外吸收物质含量的影响

细胞膜是细胞内、外物质交流的通道，当细菌菌体受到抗菌物质作用时，细胞膜受损并丧失功能。细胞膜受损后细胞内K+和PO43-等小分子物质外渗至胞外，随后DNA，RNA 等大分子物质也发生外泄。因此，测定胞外核酸物质的含量可作为评价细胞膜完整性的指标[23]。应试菌CFS 处理对受试菌菌体紫外吸收物质的影响见图3，在0～20 h范围内，试验组OD260nm值比对照组增加11.95%，说明植物乳杆菌DL3 破坏了腐败希瓦氏菌细胞膜的完整性，使胞内核酸物质外泄。

2.5 应试菌CFS 对受试菌的蛋白质合成的影响

蛋白质泄露是评定细菌细胞膜完整性的一个重要指标[24]。经植物乳杆菌DL3 处理的腐败希瓦氏菌总可溶性蛋白的SDS-PAGE 图谱如图4所示，图中1 道为试验组，2 道为对照组。可以看出，与对照组相比，经应试菌CFS 处理的试验组的条带颜色变浅且数量减少，表明应试菌CFS 处理可影响受试菌总蛋白质的合成。Sitohy 等[25]利用大豆球蛋白处理单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）后发现细菌细胞内蛋白质的合成受到较大的影响。

2.6 受试菌扫描电镜观察

经应试菌CFS 处理的受试菌扫描电镜结果见图5，从中可以看出，对照组的受试菌菌体生长良好，表面光滑，圆润，呈杆状。经应试菌处理12 h后，菌体两端出现破损，细胞原生质发生泄漏，表明应试菌CFS 对受试菌细胞壁具有破坏作用。Wen 等[26]通过扫描电镜结果发现经植物乳杆菌K25 处理后的蜡样芽胞杆菌菌体细胞壁被破坏，细胞整体结构坍塌导致细胞质泄露，研究结果与本试验相似。

3 结论

本文研究了由传统东北酸菜中分离筛选出的植物乳杆菌DL3 对腐败希瓦氏菌抑菌作用的机理，结果表明植物乳杆菌DL3 对腐败希瓦氏菌的菌体生长具有抑制作用，经植物乳杆菌DL3 处理的腐败希瓦氏菌的细胞膜通透性和电导率同时增加，核酸物质外泄，蛋白质合成受到影响。扫描电镜观察腐败希瓦氏菌菌体细胞壁被破坏，细胞质发生泄漏。综上表明植物乳杆菌DL3 通过改变菌体细胞膜的通透性，破坏细胞膜完整性，影响蛋白质合成等方式抑制腐败希瓦氏菌的生长繁殖。