酸性稻田土n-damo细菌的多样性和丰度

2021-01-14常佳丽张元勤马旭光

乐山师范学院学报 2020年12期

常佳丽，张元勤，江滔，马旭光

(乐山师范学院化学与资源环境学院，四川乐山614000)

0 引言

亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, n-damo)是由一类特殊功能菌介导完成、在厌氧条件下耦合甲烷氧化与亚硝酸盐还原的酶促反应过程[1-2]。Ettwig等通过厌氧富集培养和宏基因组学技术手段，在河流底泥中检测到n-damo功能菌的存在，并命名为CandidatusMethylomirabilis oxyfera (M.oxyfera)[3-5]。该类菌在厌氧条件下，通过新型胞内自产氧途径氧化甲烷，并获取生长代谢的能量[5]。甲烷单加氧酶是甲烷氧化代谢途径的关键酶，编码甲烷单加氧酶ɑ亚基的pmoA基因可作为鉴定n-damo细菌的遗传分子标记[6]。

在污水厌氧生物处理领域，存在厌氧段温室气体甲烷无序排放、出水总氮不达标等问题，限制了厌氧技术在水处理领域的大规模推广应用。N-damo过程可利用原位产生的甲烷进行脱氮，无需外源添加其他碳源，同时实现温室气体的减排和出水总氮的达标，是兼具环境友好型和经济节约型的新型脱氮工艺，具有潜在应用前景[7-8]。

近年来，越来越多研究证实n-damo功能菌在自然界中分布广泛，河流底泥、湿地、河口沉积物、淹水稻田土、剩余污泥等生态系统中均不同程度检测到n-damo细菌的存在[9-15]，但鲜有研究报道酸性环境中该类菌的赋存情况。此外，n-damo细菌生长代谢速率低、代时长，富集培养耗时久，限制了n-damo在实际污水处理中的推广应用[16]。因此，从其他生境中寻找更多n-damo菌源进行富集培养驯化是未来该领域发展的重要方向之一，也是突破应用瓶颈的关键所在。

基于此，本研究重点关注酸性厌氧生境典型代表——发育自酸性红壤的淹水稻田土，借助微生物分子生态学检测手段，解析其中n-damo细菌的多样性和丰度，以期为后续的富集培养研究提供菌源。

1 材料与方法

1.1 土样的采集及理化性质的测定

本研究选取四川眉山(经纬度：E 103°14′20″；N 45°51′58.87″)稻田土作为研究对象，采用五点随机采样法采集三块不同点位的稻田土壤样品(分别命名为MS-I，MS-II和MS-III)。采样时间为2019年6月，正值水稻种植晚期，稻田为淹水状态，自水土交界面向下延伸20 cm采集表层土样。采集的土样经充分混匀后，无菌条件下，取0.5 g置于2 mL bead-beating离心管中，低温运输至实验室，-80℃保存，用于后续分子生物学检测。剩余土样风干后，剔除植物残体、石砾，研磨过筛，常温保存，用于土壤理化性质的测定。土壤有机质和全氮含量采用国家标准检测方法(GB9848-44和HJ-717-2014)进行测定，土壤分别用去离子水和1 mol/L KCl浸提后，采用酸度计(雷磁，PHS-25)测定pH值。

1.2 土样核酸DNA的提取

采用土壤核酸提取试剂盒(MP FastDNASpin Kit for Soil)，参照试剂盒方法说明书，提取土壤样品的核酸DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳，检测土样DNA的提取情况，采用超微量分光光度计(Biofuture，MD2000D)测定核酸浓度和纯度。

1.3 基于n-damo细菌16S rRNA基因和pmoA基因的聚合酶链式反应和克隆测序

以1.2提取的DNA为模板，采用巢式聚合酶链式反应(nested-polymerase chain reaction, nested-PCR)扩增样品中n-damo细菌的16S rRNA基因和pmoA基因，PCR扩增引物参见表1；采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化)纯化目标基因的扩增产物；利用DNA T4连接酶将纯化后的目标基因连接至pMD19-T质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌JM109的感受态细胞中，利用蓝白斑筛选，得到含有目标基因的阳性克隆子；分别随机挑选30个含有n-damo细菌16S rRNA基因和pmoA基因的阳性克隆子，送样至上海生工测序平台进行一代Sanger法测序。

续表

1.4 系统发育树的构建

将测序结果上传至NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获取相应参比序列，利用MEGA 5.0软件，经Neighbor-joining计算方法比对建树后，明确待测菌株的遗传学分类。

1.5 基于n-damo细菌16S rRNA基因和pmoA基因的定量PCR

以1.2提取的DNA为模板，采用定量PCR技术(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测样品中n-damo细菌的丰度，qPCR检测试剂为Power SYBR Green PCR Master Mix(Promega)，检测仪器为实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)，qPCR引物详见表1。

2 结果与讨论

2.1 眉山稻田土理化性质分析

本研究共采集3份土样，去离子水浸提pH值均小于6.0，1 mol/L KCl浸提pH值均小于5.5，有机质和总氮含量分别在20～30 g/kg和1.0～2.0 g/kg范围内波动(表2)。根据2015年洪雅县土肥站的土壤养分调研报告[17]，本研究所涉及土样均属于微酸性中等养分水平土壤。已知n-damo细菌在中性环境分布广泛[9-15]，但鲜有研究报道酸性环境中该类群的多样性及丰度，故解析酸性土样中n-damo菌的赋存情况，对开辟新的菌源意义重大。此外，寻找特殊生境条件下的n-damo细菌，有助于富集培养具有独特生理代谢功能的微生物，例如嗜酸性的n-damo细菌，用于低pH污水的深度脱氮处理。

表2 土样的基本理化性质

2.2 N-damo细菌的定性检测

根据文献可知，巢式PCR第二段扩增反应的目标基因长度分别为460 bp(16S rRNA基因)和389 bp(pmoA基因)[4,6]。本研究成功扩增得到n-damo细菌特异性的16S rRNA基因和pmoA基因，如图1所示，泳道1、3和5为核酸DNA Marker(100 bp ladder，自下而上依次为100 bp ～ 600 bp)，2和4分别对应n-damo细菌特异性pmoA基因和16S rRNA基因片段，扩增条带清晰、亮度高、无非特异性扩增条带、扩增长度与文献报道相吻合，可进行后续克隆测序分析。

图1 n-damo细菌16S rRNA和pmoA基因巢式PCR第二段扩增产物电泳图谱

2.3 酸性稻田土中n-damo细菌的多样性

本研究分别对n-damo细菌特异性的16S rRNA基因和pmoA基因进行系统发育分类鉴定，以便更客观准确地反映n-damo细菌的多样性赋存情况。基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因序列相似度的聚类分析结果得出，样品中的n-damo细菌分别聚为4和3个OTUs(Operational taxonomic units，可操作分类单元)，如图2和图3中的红色圆圈所示。

系统发育分析表明，本研究检测到的n-damo细菌位于CandidatusMethylomirabilis oxyfera系统发育分支，绝大多数酸性稻田土中的n-damo细菌与其它中性生境中检测到的n-damo细菌亲缘关系较近。例如，图2的OTU1与太湖底泥环境样品克隆子TH4-27相似度达98%以上[12]，其余OTUs与西溪湿地、红树林湿地沉积物、黄河河口底泥、中性稻田土壤等环境样品中的n-damo细菌均具有较高的相似度(图2和图3)[9-11]。此外，研究还发现，基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因的系统发育分析结果均指示，酸性稻田土中存在未知OTU(图2的OTU4和图3的OTU3)，与现有数据库中的序列均不匹配，推测本研究土样中可能含有独特的n-damo细菌。后续研究工作可增加样本量，采集更多酸性环境土壤样本，以验证本研究的检测结果。

图2 基于n-damo细菌16S rRNA基因的系统发育树

基于n-damopmoA基因的系统发育树树根为好氧甲烷氧化菌Methylomonas，从图3可知，本研究扩增所得pmoA基因序列全部归属于CandidatusMethylomirabilis oxyfera系统发育分支，未见好氧甲烷氧化菌，证实了cmo182-cmo586这对引物的专一性，利用该引物对能够靶向鉴定环境样品中n-damo厌氧甲烷氧化菌的赋存情况[6]。

图3 基于n-damo细菌pmoA基因的系统发育树

2.4 酸性稻田土中n-damo细菌的丰度

本研究采用针对n-damo细菌16S rRNA基因和pmoA基因的定量PCR，检测酸性稻田土中n-damo细菌的丰度。研究共检测了三块样田，MS-I、MS-II和MS-III样田中n-damo 16S rRNA基因拷贝浓度分别可达1.25 × 108、2.31 × 108和1.34 × 108拷贝每克干重，pmoA基因拷贝浓度分别为8.66 × 106、2.54 × 107和1.55 × 107拷贝每克干重。其中，pmoA基因普遍比16S rRNA基因丰度低一个数量级，可能的原因在于n-damo细菌单个细胞中含有多个16S rRNA基因拷贝，但通常pmoA基因为单拷贝。对比其他研究发现，不同生境中的n-damo细菌16S rRNA基因丰度值波动较大，其中，三峡江水水位波动带最低，仅为4.70 ×102copies /g，长江河口沉积物最高，可达9.77×107copies / g[18]。本研究16S rRNA基因拷贝浓度与长江河口沉积物生境的丰度相当，甚至更高，暗示酸性稻田土可能是n-damo功能菌的适宜生境。