胆囊癌相关成纤维细胞分泌IGFBP3促进淋巴内皮细胞的迁移

张 瑞，陈 晨，宋虎伟，李 起，张 东，李文智，王 林，耿智敏

(西安交通大学第一附属医院：1. 肝胆外科；2. 老年外科，陕西西安 710061)

胆囊癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，发病率居于胆道系统肿瘤的首位，5年生存率仅为5%[1]。由于发病隐匿，多数患者在就诊时已处于晚期，常伴有淋巴转移。淋巴转移是胆囊癌最常见的转移方式，也是影响患者预后的独立危险因素之一[2]。因此，研究淋巴转移机制，寻找相关诊断和治疗的分子标志物，对于胆囊癌的诊治具有重要的临床意义。而目前尚不清楚胆囊癌淋巴转移的分子机制[3]。近期研究表明，淋巴内皮细胞(lymphatic endothelial cells, LECs)参与肿瘤细胞与淋巴管的相互作用，并在肿瘤的淋巴转移过程中发挥关键性作用[4]。

间质纤维化反应是许多实体肿瘤的生物学特性，已有大量研究证实胆管癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤具有显著的纤维化特征[5-7]，胆囊癌亦有明显的间质纤维化反应，这与肿瘤间质中成纤维细胞含量密切相关。肿瘤相关性成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境的重要组成成分之一，参与了肿瘤细胞增殖、肿瘤免疫、血管生成、淋巴转移和耐药性等多个过程[8-9]。本课题组在前期研究中通过酶消化法从患者离体胆囊癌组织中成功地提取出CAFs，并证实其可以明显促进肿瘤细胞的增殖和侵袭[10]。目前尚不清楚CAFs对胆囊癌淋巴转移的影响及机制。本研究在前期研究基础上，进一步研究CAFs对LECs迁移的影响及可能的相关机制，旨在阐明胆囊癌的淋巴转移机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2009年1月至2011年12月于西安交通大学第一附属医院肝胆外科收治住院的胆囊癌患者手术切除的组织标本83例，术中取材后立即保存于40 g/L多聚甲醛中。所有组织标本均经病理证实为胆囊癌。本课题经西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核。所有入组患者均签署知情同意书。

1.2 细胞株及实验试剂人淋巴管内皮细胞(human lymphatic endothelial cells, HLECs)购自中科院上海细胞库。实验所用的胆囊癌CAF及胆囊成纤维细胞(normal fibroblasts, NFs)通过酶消法分别从胆囊癌和胆囊慢性炎症组织中进行原代提取。F12、RPMI 1640及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自Sigma公司；重组人IGFBP3购自以色列PROSPEC公司；2-Deoxy-D-glucose(2-DG, IGFBP3抑制剂)购自中国上海陶素生化科技有限公司；RIPA裂解液(强)购自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜和ECL发光液购自美国Millipore公司；Transwell小室购自美国Corning公司；兔抗人α-SMA和IGFBP3购自CST公司；SP9000免疫组化试剂盒(包括封闭用山羊血清、生物素、标记二抗和辣根酶标记链酶卵白素)购自北京中杉生物技术有限公司；Western blotting所用的β-actin、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗购自美国Sigma公司；二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；IGFBP3、IL6和TGF-β三种ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司。

1.3 细胞提取、培养和分组课题组前期通过酶消化法从患者离体的胆囊癌组织中成功提取到肿瘤成纤维细胞(CAF)[10]。本研究中用同样的方法分别从胆囊癌组织和胆囊慢性炎症组织中提取CAFs和NFs。首先收集患者因胆囊癌和胆囊结石或慢性炎症行手术切除的胆囊组织标本，将组织剪碎至1 mm3大小碎片，放置于含20 μL/mL DNaseI的Ⅱ型胶原酶(1 mg/mL)中，37 ℃孵育4 h，离心后再重悬于完全培养基，应用胰酶消化法和差速贴壁法对成纤维细胞进行纯化。培养48 h，收集相应的条件培养基。CAF、NF和HLEC细胞分别用含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的F12和RPMI 1640培养基，于50 mL/L CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养。实验分组：空白对照组(正常培养基组)、CAF-CM(CAF条件培养基)组、NF-CM组(NF条件培养基)、IGFBP3组(正常培养基里加入100 ng/mL IGFBP3)、CAF-CM+2-Deoxy-D-glucose(加入5 mmol/L 2-Deoxy-D-glucose)联合干预组。

1.4 Transwell小室迁移实验用无血清培养基重悬HLEC细胞并调整细胞密度约为5×105/mL。在Transwell小室的上室每孔加入200 μL细胞悬液(约1×105个细胞)；分组同1.3项，设3个复孔，将细胞置于37 ℃培养箱培养48 h后，取出小室，弃去上室中的培养液，用棉签拭去小室上层残存的细胞；多聚甲醛固定细胞20 min，结晶紫染色20 min，充分漂洗多余的染液，显微镜下随机观察10个视野计数，并取均数。以上实验重复3次。

1.5 划痕实验取对数生长期的HLEC细胞，以5×105个/孔接种至6孔板中，培养24 h后用200 μL枪头沿培养板底部呈“一”字划痕，PBS清洗细胞3次，去除残留的细胞，更换为相应培养基，分组同1.3项。置37 ℃培养箱培养，于0、24 h分别拍照，计算划痕闭合率。ImageJ软件计算细胞迁移率(%)=[(0～24)h的面积/0 h的起始面积]×100%。

1.6 Western blotting检测蛋白表达将HLEC细胞根据1.3项分组做相应处理，72 h后收集细胞，用RIPA裂解液将细胞充分裂解后提取蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。将待检测蛋白样品上样后，SDS-PAGE电泳分离，转膜；50 g/L脱脂牛奶室温下封闭2 h后，加入按适当比例稀释的一抗β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin(均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST清洗膜后加适当比例稀释的二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜后进行化学发光显影。

1.7 ELISA检测常见的CAFs分泌因子的含量按相关文献报道[11-12]进行ELISA实验。将对数生长期CAF、NF细胞接种于24孔板中培养48 h后，收集上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，分别测定相应上清液中IGFBP3、IL-6和TGF-β水平，实验重复3次，取平均值。

1.8 半定量细胞因子芯片检测按相关文献报道[11-12]，对胆囊癌CAF和NF上清进行相关细胞因子芯片半定量检测，筛选差异细胞因子。将对数生长期CAF、NF细胞接种于24孔板中培养48 h后，收集上清液，采用北京博奥晶典生物公司提供的RayBiotech人半定量细胞因子芯片AAH-CYT-G5-8进行常见细胞因子检测，按照芯片说明书操作，抗体芯片样本图像用扫描仪进行扫描，提取芯片数据，应用扫描仪配套的分析软件计算出每个有表达意义细胞因子的差异倍数值，按差异倍数值>2.0倍表示该细胞因子表达上调，差异倍数值<0.5倍表示该细胞因子表达下调，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.9 免疫组织化学检测以α-SMA标记CAFs，染色程度提示CAFs在胆囊癌和癌旁组织中的含量。将胆囊癌及癌旁组织标本包埋成蜡块，制作成相应的组织芯片，进行免疫组化实验：组织芯片脱蜡-脱水后，30 mL/L H2O2孵育10 min，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波修复20 min；山羊血清封闭15 min后滴加适当比例稀释的一抗(α-SMA 1∶400；IGFBP3 1∶800)，放于4 ℃冰箱中过夜；第2天将芯片复温后依次加入二抗和辣根酶标记链酶卵白素孵育后，DAB显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。

1.10 统计学处理采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组样本比较采用方差分析和多重比较(Dunnett-t检验)分析每组与对照组之间的差异；α-SMA表达与临床病例资料间的相关分析采用χ2检验和Fisher’s确切概率检验。利用GraphPad Prism 7进行图表绘制，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CAF-CM促进LEC细胞迁移Transwell迁移和划痕实验评价CAF-CM对LEC细胞迁移能力的影响。划痕实验结果显示，CAF-CM组划痕闭合率[(51.01±5.72)%]明显高于对照组[(19.88±2.80)%]和NF-CM组[(23.6±3.45)%]，差异有统计学意义(图1A，P<0.05)；同样，Transwell迁移实验结果显示，CAF-CM组穿膜细胞数[(106.80±5.53)个]明显高于对照组[(75.00±6.32)个]和NF-CM组[(83.60±4.40)个]，差异有统计学意义(图1B，P<0.01)，说明CAF-CM可以明显增强LEC细胞的迁移能力。

2.2 CAF-CM对LEC细胞中迁移相关蛋白表达的影响与对照组和NF-CM组相比，CAF-CM组的LEC细胞中E-cadherin的表达明显降低；同时N-cadherin和Vimentin的表达显著升高，表明CAF-CM可以促进LEC细胞的EMT转化，进而引起细胞迁移(图1C)。

2.3 CAF-CM和NF-CM中分泌蛋白因子的检测通过人半定量细胞因子芯片检测两种细胞上清液中HGF、IGFBP3、CSF2、TGF-β、IL-6、IL-8等常见细胞因子的含量，根据芯片荧光杂交点阵和样品信号结果提示CAF-CM中IGFBP3(P<0.01)、IL-8(P<0.05)含量明显高于NF-CM，且两种因子信号值存在明显差异(图2A、图2B)。本研究主要观察IGFBP3在CAFs与LECs相互作用中的影响。

结合相关文献报道，进一步通过ELISA实验验证常见的CAFs分泌细胞因子的含量，结果显示，CAF和NF细胞上清液中IGFBP3分泌量分别为(3 928.2±332.8)pg/mL和(2 473.0±220.3)pg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)；而IL-6和TGF-β分泌量在两组之间差异无统计学意义(P>0.05，图2C)。

图1 CAF-CM对LEC细胞迁移能力及EMT通路相关蛋白表达的影响

图2 RayBiotech人半定量细胞因子芯片检测CAF-CM中显著变化的细胞因子情况

2.4 CAFs在胆囊癌和癌旁组织中的表达及其与临床病例特征的关系以α-SMA标记CAFs染色程度提示CAFs在胆囊癌和癌旁组织中的含量。免疫组化检测结果显示：α-SMA在胆囊癌组织中阳性表达59例，阳性率为71.08%，癌旁组织中阳性表达34例，阳性率为53.13%，两组之间α-SMA阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)；IGFBP3在胆囊癌中阳性表达55例，阳性率为66.27%，癌旁组织中阳性表达29例，阳性率为45.31%，两组之间IGFBP3阳性表达差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 胆囊癌组织及癌旁组织中α-SMA和IGFBP3的表达与比较

根据α-SMA和IGFBP3染色程度，将83例胆囊癌组织分为α-SMA高表达组(n=59)和α-SMA低表达组(n=24)；IGFBP3高表达组(n=55)和IGFBP3低表达组(n=28)。结合胆囊癌患者的临床病理特征分析发现：胆囊癌中α-SMA表达与性别、年龄、病理类型、肿瘤分级、肝脏浸润不相关(P>0.05)，与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期和IGFBP3表达显著相关(P<0.05，表1)。

2.5 CAF-CM中的IGFBP3促进LEC细胞的迁移Transwell迁移实验结果表明，相较于对照组穿膜细胞数(91.20±4.25)个，CAF-CM组穿膜细胞数(117.00±6.91)个、IGFBP3组穿膜细胞数(115.00±4.46)个明显增多(图4A，P<0.05)，同时在CAF-CM中加入IGFBP3的抑制剂2-DG[(86.4±6.00)个]可以逆转CAF-CM对LEC细胞迁移的影响，差异有统计学意义(P<0.05)；同样，划痕实验结果显示，相较于对照组划痕闭合率(23.84±3.40)%，CAF-CM组划痕闭合率(63.97±6.39)%、IGFBP3组划痕闭合率(59.23±5.08)%明显增高(图4B，P<0.01)，同时CAF-CM+2-DG组划痕闭合率[(26.39±4.63)%]明显减低，差异有统计学意义(P<0.01)。说明CAF-CM中IGFBP3可以明显增强LEC细胞的迁移能力，加入IGFBP3抑制剂后可以明显逆转这种效应。

表1 胆囊癌α-SMA表达与胆囊癌患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between α-SMA expression and clinicopathological features of the patients with gallbladder carcinoma

图4 IGFBP3对LEC细胞迁移能力及EMT通路相关蛋白表达的影响

2.6 CAF-CM中的IGFBP3对LEC细胞中EMT相关蛋白的影响与对照组相比，CAF-CM组和IGFBP3组的LEC细胞中E-cadherin的表达明显降低；而N-cadherin和Vimentin的表达则明显升高；同时在CAF-CM中加入2-DG后，LEC细胞中的3种蛋白表达出现恢复(图4C)。这表明，CAF-CM中IGFBP3主要通过影响EMT转化促进LEC细胞的迁移。

3 讨 论

肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)，也称为肿瘤基质或肿瘤间质，包括成纤维细胞、免疫细胞、血管、淋巴管和细胞外基质，对肿瘤的发生和转移产生重要影响[13]。CAFs是肿瘤间质的重要组成成分之一，不仅为肿瘤细胞提供物理支撑，同时也是肿瘤关键的功能调节剂，可以通过直接分泌和旁分泌方式调节肿瘤细胞和其他基质细胞的生物学特性，释放出多种调节因子，合成和重塑细胞外基质，从而影响肿瘤的启动和发展。胆道恶性肿瘤具有间质纤维化的特征[5,14]，在胆管癌的研究中已发现CAFs可以明显促进肿瘤细胞的多种生物过程，如增殖、侵袭和EMT[15-18]。但在胆囊癌中CAFs的相关报道较少，本课题组前期通过组织块法和酶消化法建立了人CAFs的原代培养方法，从胆囊癌组织中成功提取出CAF细胞，并发现CAFs可明显促进胆囊癌细胞增殖和侵袭。

转移是胆囊癌预后不良的主要原因。大量研究表明，导致肿瘤转移存在多种机制，但主要途径仍是通过血液和淋巴管进行转移[19]。与血管不同，淋巴管是由单层内皮细胞构成的，缺乏基底膜、周细胞或平滑肌细胞，更易于产生肿瘤细胞的浸润[20]。STACKER等[21]认为新生淋巴管的形成和现有淋巴管的重塑是癌症淋巴转移的两个重要步骤。淋巴管新成是指从先前存在的淋巴管生成新淋巴管，涉及LECs的增殖、迁移和出芽生长；而现有淋巴管的重塑主要是LEC细胞在多种细胞因子的作用下发生迁移的过程。在淋巴转移过程中，肿瘤细胞先侵入周围的淋巴小管，然后到达邻近的引流淋巴结，随着淋巴液或者血液循环而出现远处转移。LECs在肿瘤转移中发挥重要作用，其增殖和迁移有助于淋巴管的萌发，而淋巴管生成和淋巴液增多促发了肿瘤的淋巴转移过程[21-22]。已被证实肿瘤淋巴管生成可预测区域淋巴结转移并促进向远处器官的扩散。近期有研究表明，CAFs可以明显促进肿瘤淋巴管形成，MASSIMILIANO等[23]发现PDGF-D可刺激肿瘤成纤维细胞产生VEGF-C和VEGF-A，导致淋巴管扩张和肿瘤细胞浸润，提示在胆管癌早期转移中可通过诱导CAF凋亡或抑制PDGF-D而阻止淋巴转移。同样，日本一项食管癌临床样本的研究揭示，CAFs促进淋巴结转移，并使用原位转移小鼠模型在体内外验证细胞间关系，证实了CAFs的积累明显促进了食管鳞癌的淋巴结转移[24]。然而，尚不清楚胆囊癌中CAFs与LECs之间是否存在关联以及其作用机制。

本研究探索了CAFs对淋巴内皮细胞迁移能力的影响及作用机制。研究发现CAF-CM干预LEC细胞后，其迁移能力明显增强，显著下调E-cadherin表达，上调N-cadherin和Vimentin的表达；蛋白因子芯片和ELISA结果显示，CAF条件培养基与NF条件培养基中IGFBP3表达存在明显差异；胆囊癌组织芯片免疫组化分析显示α-SMA表达与淋巴转移、TNM分期及IGFBP3表达存在显著相关性；进一步进行体外实验，研究了淋巴管生成过程的机制，结果显示外源性的IGFBP3可以促进LEC细胞迁移，同时在CAF-CM中加入IGFBP3的抑制剂后，可以逆转CAF-CM单独诱导细胞迁移和迁移相关蛋白的表达。

综上所述，本研究结合临床组织样本和体外细胞实验，结果表明CAFs通过分泌IGFBP3影响EMT转化，从而促进LEC细胞的迁移。初步阐明了IGFBP3在胆囊癌淋巴转移过程中的关键作用，提示其可以作为胆囊癌抗淋巴转移治疗中一个有潜力的治疗靶标，为胆囊癌的淋巴转移机制提供新的理论依据。