沙库巴曲缬沙坦对糖尿病心肌病大鼠的保护作用及其机制

王 涛，易登良，范忠才

(西南医科大学附属医院心血管内科，四川泸州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是一种因慢性高血糖和胰岛素抵抗诱发的且排除冠状动脉疾病、高血压病、心脏瓣膜病等明确病因的一种特殊的心脏疾病，可逐渐进展为心室收缩功能障碍，最终发展为终末期心力衰竭[1-2]。然而，目前DCM具体发病机制仍不明确。有多项研究表明可能与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)激活、心肌纤维化、氧化应激、细胞凋亡等相关[3]。在DCM的病理生理过程中，RAAS系统过度激活有重要作用，可加重心肌纤维化、心肌细胞异常凋亡[4]，临床常以此作为治疗靶点。目前临床上广泛使用的治疗药物有血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)/血管紧张素受体Ⅱ抑制剂(angiotensin Ⅱ receptor antagonist, ARB)，缬沙坦便是其中重要代表药物之一。尽管如此，DCM的死亡率仍未得到明显降低，预后极差[5-6]。

沙库巴曲缬沙坦(sacubitril valsartan sodium, 又名LCZ696)是由抑制脑啡肽酶与血管紧张素受体组成的复合制剂，是首个血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(angiotensin receptor neprilysin inhibitor, ARNi)，其在抗心力衰竭、保护心脏功能过程中的作用已得到证实[7]；在射血分数下降、射血分数保留的心力衰竭中均起到有益作用，而且可以降低住院风险、心血管死亡风险[7-8]；还有研究证实其对心肌肥厚、心肌纤维化起到保护作用[9]。因此，通过研究LCZ696对DCM大鼠心肌是否有保护作用，从而为DCM的防治提供一些新的治疗方向。本研究通过建立DCM大鼠心力衰竭模型，观察LCZ696对DCM大鼠TGF-β1/Smads、Bcl-2/caspase-3、Fas/FasL及降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)等的影响，进一步探讨其对心脏保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂健康雄性SD大鼠40只，约150 g/只，SPF级8周龄，由西南医科大学实验动物中心提供。所有操作均遵循西南医科大学实验动物的操作规范，饲养期间自由进食及饮水；高糖高脂饲料(配方为10%猪油、20%蔗糖、6%蛋白粉、61%常规饲料)由成都达硕饲料公司提供，许可证编号苏饲审(2009)05032；链脲佐菌素(STZ，S0130)购自美国Sigma公司，TGF-β1、Smad7、caspase-3、Bcl-2、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、Fas/FasL抗体均购于恒意赛，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒由Roche公司提供。本研究经医院伦理委员会批准，符合动物伦理相关规定。

1.2 模型建立及实验分组采用高糖高脂饮食联合腹腔注射STZ法制备糖尿病模型后，以普通饲料继续喂养，分别在第4周、第6周、第8周处死2只大鼠，观察心肌结构，发现在第8周时大鼠的心肌结构改变，视为DCM造模成功。将大鼠随机分为4组(n=5)。control+alcohol组、DCM+alcohol组予以等量等浓度乙醇溶剂灌胃，DCM+VST组予以缬沙坦+乙醇溶剂30 mg/(kg·d)，DCM+SVST组予以LCZ696+乙醇溶剂60 mg/(kg·d)，持续8周(按照SUEMATSU等[10]实验中所应用剂量)。

1.3 心脏超声评估心脏结构及功能变化实验干预结束后常规称量体质量，使用30 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉后采用超声检测仪检测。采用彩色多普勒超声显像仪(GE Vivid E9)，探头频率3.5 MHz，主要记录的参数包括舒张期左心室内径(LVIDd)、收缩期左心室内径(LVIDs)、左心室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(LVFS)等值。

1.4 HE及Masson染色观察心肌病理组织学变化心脏彩超检查结束后随即处死大鼠，解剖大鼠并快速取出心脏，反复清洗并分离心室肌，常规固定并制作石蜡切片，HE染色及Masson染色，普通光学显微镜下观察。

1.5 TUNEL染色观察心肌细胞凋亡各组石蜡切片按照TUNEL试剂盒操作步骤进行操作，并滴加抗荧光猝灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察计算凋亡的心肌细胞，绿色荧光细胞核为阳性结果。

1.6 免疫组化检测心肌TGF-β1、Smad7、CGRP蛋白的表达各组石蜡切片常规脱蜡处理，用30 mL/L过氧化氢阻断灭活内源性过氧化物酶，抗原修复，封闭，加一抗(TGF-β1、Smad7、CGRP)，4 ℃冰箱过夜，次日滴加二抗孵育，洗片， 显色，苏木素复染10 s，脱水，透明，封片。在光学显微下观察，应用Image Pro Plus 6.0软件计算各组平均吸光度(A)值。

1.7 Western blotting检测心肌Bcl-2、caspase-3、Fas/FasL蛋白表达取心肌组织适量，使用细胞裂解液提取蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度。样品蛋白上样进行SDS-PAGE电泳后，转膜至PDVF膜，封闭2 h。滴加一抗(Bcl-2、Fas的稀释浓度为 1∶500，caspase-3、FasL的稀释浓度为 1∶1 000)，4 ℃过夜，次日滴加二抗(1∶10 000)，孵育后洗膜。显色、曝光，保存胶片。使用image J软件分析目的条带灰度值，使用GAPDH条带进行灰度值校正。

2 结 果

2.1 各组大鼠心脏彩超结果及比较与control+alcohol组相比，DCM+alcohol组大鼠的LVEF、LVFS下降(P<0.05)；与DCM+alcohol组相比，DCM+VST组、DCM+SVST组的LVEF、LVFS均升高(P<0.05)，但以DCM+SVST组升高更为明显(P<0.05，图1、表1)。

图1 各组大鼠心脏彩超的检测结果

表1 各组大鼠心脏超声结果的比较Tab.1 Comparison of ultrasonic cardiogram results among different rat heart groups (n=5,

2.2 各组大鼠心肌组织的病理学改变control+alcohol组心肌纤维排列整齐，细胞结构清晰，细胞核大小均一；DCM+alcohol组心肌纤维排列紊乱、稀疏，心肌细胞肥大变性，细胞核大小不一，心肌间蓝染的胶原纤维增加；与DCM+alcohol组相比，DCM+VST组、DCM+SVST组心肌细胞肥大及胶原排列紊乱得到改善，心肌间蓝染的胶原纤维较少，以DCM+SVST组更为明显(图2)。

图2 各组大鼠心脏组织的病理学改变

2.3 各组大鼠心肌组织TUNEL染色情况正常心肌细胞核呈蓝黑色，凋亡细胞核呈绿色荧光，与control+alcohol组比较，DCM+alcohol组心肌细胞凋亡数量明显增加(P<0.05)；与DCM+alcohol组比较，DCM+VST组、DCM+SVST组较凋亡细胞均减少(P<0.05)，以DCM+SVST组减少程度明显(P<0.05，图3)。

图3 各组大鼠心脏组织TUNEL染色结果及比较

2.4 各组大鼠心肌组织免疫组化染色结果与control+alcohol组比较，DCM+alcohol组大鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达增加(P<0.05)，Smad7、CGRP蛋白表达下降(P<0.05)；与DCM+alcohol组比较，DCM+VST组、DCM+SVST组TGF-β1蛋白表达降低(P<0.05)，Smad7、CGRP蛋白表达增加(P<0.05)，以DCM+SVST组变化程度更为明显(P<0.05，图4)。

图4 各组大鼠心脏组织TGF-β1、Smad7、CGRP免疫组化染色结果

2.5 各组大鼠心肌组织caspase-3、Bcl-2、Fas/FasL蛋白的表达情况与control+alcohol组比较，DCM+alcohol组大鼠心肌组织Bcl-2表达明显下降(P<0.05)，caspase-3、Fas/FasL蛋白表达明显增加(P<0.05)；与DCM+alcohol组相比，DCM+SVST组、DCM+VST组大鼠心肌组织Bcl-2表达增加(P<0.05)，caspase-3、Fas/FasL蛋白表达下降(P<0.05)，且DCM+SVST组优于DCM+VST组(P<0.05，图5)。

3 讨 论

DCM是糖尿病的特异性心肌病变，发病机制复杂，涉及多种调控途径，目前尚未阐述清楚，可能源于高血糖状态下各种因素共同影响心肌纤维化、心肌细胞凋亡等改变。若能阻断或改善上述改变，则可能带来临床获益，也是目前研究临床药物治疗的作用靶点。

LCZ696在抑制血管紧张素Ⅱ的受体1(AT1)的同时，其中性脑啡肽酶抑制剂(enkephalinase inhibitor, NEPi)可以增加内源性活性肽，抑制脑啡肽酶活性，减少体内生物活性物质降解，增加如利钠肽、CGRP等含量[11]，达到利尿、扩血管作用。其中CGRP是目前已知的最强舒张血管的活性多肽，在保护心血管系统中有重要意义。有证据显示，CGRP可改善心肌纤维化、心肌细胞凋亡等病理改变[12]。ARB以其代表药物缬沙坦为例，大量研究表明，缬沙坦对于DCM有改善心肌纤维化、减少细胞凋亡等作用。抑制脑啡肽酶活性的同时，抑制RAAS系统或许可以为DCM患者带来更大的临床获益，开创出新的治疗手段。LCZ696由约24 mg沙库巴曲和26 mg缬沙坦组成，约等于以1∶1混合复合制剂，因此60 mg/kg LCZ696中约等于含有30 mg/kg缬沙坦。本研究旨在证实LCZ696对DCM 心肌纤维化、心肌细胞异常凋亡等的影响，判断LCZ696除去同等剂量缬沙坦成分可实现的作用效果外，NEPi组分在DCM中是否对ARB抗心肌纤维化、抗细胞凋亡产生协同、增量效应，以及发现可能参与其中的相关生物活性肽。

本研究针对大鼠功能及病理变化的结果显示，与DCM组相比较，DCM+SVST组、DCM+VST 组心脏功能和心肌病理结构得到明显改善，以LCZ696治疗后改善更为明显，据此认为LCZ696对于DCM治疗是有效的，且疗效优于单独使用等剂量缬沙坦。

有研究证明，DCM心肌纤维化中的TGF-β1/Smads信号通路有重要作用。在高糖影响下，活化的TGF-β1募集并磷酸化其下游Smad2和Smad3，促进纤维化的发生发展，而抑制型Smad7通过与Smad2/3竞争性结合TGF-β1，阻断Smad2/3的激活，达到抗纤维化作用[13-14]。本研究结果显示，与DCM组大鼠相比较，DCM+SVST组、DCM+VST组均可以下调TGF-β1表达，上调Smad7表达，进而调节TGF-β1/Smads通路，减轻心肌纤维化，以DCM+SVST组改变更为明显。

有研究证实，缬沙坦可通过调控caspase-3、Bcl-2、Fas/FasL改善DCM心肌细胞凋亡，其中caspase-3被认为是凋亡通路下游的关键水解酶，一旦caspase-3被激活，凋亡将不可避免[15]。Bcl-2通过改变核内氧化还原平衡，阻止胞内Ca2+内流，抑制线粒体膜释放细胞色素-C，抑制caspase-3蛋白酶的活化，阻断细胞凋亡的进程[16]。在本研究中，与DCM组比较，DCM+SVST组、DCM+VST 组Bcl-2的表达上调，caspase-3表达下调，且DCM+SVST组改变更为明显；另外，Fas/FasL作为细胞凋亡信号通路之一，在DCM中，FasL与表达Fas的靶细胞交联后，启动凋亡信号转导途径，导致Fas表达阳性的靶细胞死亡[17]。本研究证明LCZ696可下调Fas蛋白表达，抑制Fas/FasL通路信号转导，减少心肌细胞凋亡，仍以DCM+SVST组下调明显。

CGRP对于心脏有强大的保护作用，有学者认为，CGRP水平下降可能是导致心力衰竭的重要原因之一[18]。在本研究中，与DCM组大鼠相比较，LCZ696与缬沙坦均可上调大鼠心肌中CGRP表达，LCZ696作用效果明显优于缬沙坦，表明LCZ696中NEPi可协同上调CGRP含量，增强对心肌保护作用。

综上所述，LCZ696可改善心肌纤维化、降低心肌细胞异常凋亡，且LCZ696作用效果优于等剂量缬沙坦单独治疗。LCZ696治疗DCM优于ARB的机制得益于LCZ696中的NEPi增加了CGRP表达，以协同、增加RAAS抑制剂作用，通过调控TGF-β/samds、Bcl-2、caspase-3、Fas/FasL信号通路保护心肌，可以为DCM临床治疗提供新的靶点。因此，LCZ696亦有可能成为治疗DCM的具有巨大潜力的新型药物。