GeneXpert 技术对耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分析

王 维， 王 林， 樊清清， 赵 亚

（1.西安市儿童医院检验科，西安 710003； 2.西安市第一医院检验科，西安 710002；3.西安市第一医院药剂科，西安 710002）

肠杆菌科细菌是医院感染性疾病的主要致病菌，在免疫缺陷患者中易引起严重感染[1]。碳青霉烯类药物如亚胺培南、美罗培南、厄他培南因其抗菌谱广、抗菌作用强，已成为治疗肠杆菌感染最强效β-内酰胺类药物。但近年来，长期、大量、不规范使用该类抗生素导致对其耐药的肠杆菌科细菌数量增加，使临床抗感染治疗面临严峻的考验[2]。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药复杂，其中最重要是产碳青霉烯酶，按照Ambler 分类法，编码碳青霉烯酶的耐药基因主要分为A、B、D 三类，其中最流行的碳青霉烯类型包括KPC、NDM、IMP-1、VIM、OXA-48 等[3-6]。

GeneXpert 分子检测平台是一种半巢式实时荧光PCR 体外检测系统，能弥补传统细菌培养法及传统PCR 方法检测周期长、灵敏度差等缺陷[7]，且结果的稳定性好，已广泛应用于结核分枝杆菌的利福平耐药基因、耐甲氧西林金黄葡萄球菌（MRSA）、耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）耐药基因等的检测[8]。本文采用GeneXpert 技术方法，分析西安市第一医院CRE 细菌耐药基因表型，为指导临床合理用药以及预防和控制CRE的感染和暴发流行提供参考。

1 资料与方法

1.1 材料

菌株取自2017年3月至2019年3月西安市第一医院微生物室从不同病区各种临床标本中培养出的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等CRE 共70 株，剔除同一患者重复菌株；GeneXpert 微生物快速检测系统、Xpert Carba-R试剂盒（美国赛沛公司）；全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK2 Compact、比浊仪、药敏板卡AST-GN09、AST-N335（法国梅里埃生物制品有限公司）；血琼脂培养基、MH 培养基（郑州安图生物工程股份有限公司）；基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司）；生物安全柜、细菌培养箱（上海力康公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌种鉴定及药敏 采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪对收集的菌株进行鉴定复核。采用Vitek 2-Compact 全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行药敏MIC 法实验，药敏结果采用CLSI2018 标准进行判断，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2.2 GeneXpert 法检测耐药基因 将已复苏培养的菌株配制成0.5 麦氏单位菌悬液，取10 μL加至试剂盒样本处理液中，经漩涡震荡后，吸取约1.7 mL 混合液沿管壁加入试剂盒内，启动检测。

1.3 统计学方法

药敏结果采用Whonet 5.6 软件进行分析。其他数据采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，计数资料采用率或百分比表示，组间比较采用χ2检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株分布

70 株分离菌株以肺炎克雷伯菌最为多见，共分离出26 株，占37.14%；其次是大肠埃希菌15株，占21.43%；弗氏枸橼酸杆菌7 株，占10.00%；阴沟肠杆菌和产酸克雷伯菌各6 株，各占8.57%；其他菌株10 株，占14.28%。

2.2 标本分布

标本来源以痰液为主，共有41 株，占58.57%；其次为尿液和血液，均有13 株，占18.57%；胆汁3株，占4.28%。

2.3 科室分布

CRE 菌株康复重症医学科分离最多，共有20株，占28.57%；其次为神经外科和呼吸内科各13株，各占18.57%；泌尿外科10 株，占14.28%；消化内科5 株，占7.14%；其他科室9 株，占12.86%。

2.4 药物敏感性实验结果

药敏结果提示CRE 对大部分β-内酰胺类药物呈现高度耐药性，耐药率＞80%，对环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、妥布霉素耐药率分别为63%、63%、63%、66.7%，对阿米卡星有较好的敏感性，敏感率为56.0%，未分离到粘菌素耐药的菌株。见表1。

表1 70 株CRE 菌株药敏实验结果（%）

2.5 CRE 耐药基因检测结果

GeneXpert 方法检测5 种耐药基因结果显示，携带碳青霉烯酶共57 株，占81.42%；其中，携带KPC 酶36 株，占51.43%；携带NDM 酶33 株，占47.14%；携带IMP-1 酶4 株，占5.71%；未携带可检测碳青霉烯酶13 株，占18.57%。携带单一KPC酶22 株，占31.43%；携带单一NDM酶20 株，占28.57%；携带单一IMP-1 酶1 株，占1.43%；同时携带KPC和NDM 酶11 株，占14.28%；同时携带KPC 和IMP-1 酶1 株，占1.43%；同时携带IMP-1、KPC 和NDM酶2 株，占2.86%；其余型耐药基因未检出。质控菌株ATCC25922 未检出耐药基因。见表2。

表2 70 株CRE 菌株耐药基因检出情况

2.6 检出耐药基因数与患者预后分析结果

患者不同预后情况中，CRE 菌株耐药基因检出情况差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 CRE 菌株耐药基因检出情况与患者预后分析［例（%）］

3 讨论

肠杆菌科细菌是院内感染的重要病原菌，可通过多种途径进行传播，碳青霉烯类抗菌药具有较好的通透性和广谱抗菌活性，是目前治疗革兰阴性杆菌效果较好的抗菌药物。但是随着该类药物在临床上的广泛，CRE 菌株的检出率呈逐年快速上升趋势[9]。本文结果显示，西安市第一医院2017年3月至2019年3月共分离出70 株CRE，CRE 菌株以肺炎克雷伯菌为主，其次是大肠埃希菌，弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌所占比例较低，与文献报道基本一致[10-11]。本文资料中CRE 菌株标本来源多样，以呼吸、泌尿系统来源最多，与Zhang[10]等报道相似，符合肠杆菌科细菌的感染分布特点[12]。标本主要来源于康复重症医学科、神经外科、呼吸内科等重症科室，此类科室患者病情严重，接受侵入性操作较多，免疫力较低下，加之长期应用抗生素治疗增加耐药菌株感染的机会，因此提示临床应合理使用抗生素，避免重复给药等行为的发生。

药敏结果显示，CRE 菌株对大多数抗菌药物耐药严重，特别是对β-内酰胺类药物呈现高度耐药，耐药率＞80%，对亚胺培南和美罗培南的耐药率均为92.6%；对环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、妥布霉素的耐药率分别为63%、63%、63%、66.7%；对阿米卡星敏感性尚可，敏感率为56.0%，该结果与2017 CHINET 中国耐药性监测结果一致[13]，当药物缺乏或病情相对较轻时，可考虑应用阿米卡星等药物。多黏菌素被认为是治疗CRE最有效的抗菌药物，目前未发现分离到多粘菌素耐药菌株的报道。抗菌药物的联合应用（如多粘菌素类或阿米卡星联合碳青霉烯类等）的疗效均优于单药治疗[14-15]。

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制是产生碳青霉烯酶，碳青霉烯酶可按β-内酰胺酶家族Ambler 分类分为A、B、D 类。A 类最具有代表意义的酶型是KPC，也是最具有临床意义的酶型。B 类主要包括NDM、IMP-1、VIM等。D 类主要为OXA-48[3-6]。本研究选取5种最常见基因（KPC、NDM、IMP-1、VIM、OXA-48）应用GeneXpert 技术进行检测，结果显示70 株CRE菌株检测出碳青霉烯酶基因57 株，阳性率为81.42%。其中KPC 型36 株、NDM 型33 株、IMP-1型4 株，未检出VIM 和OXA-48 型，提示肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的主要耐药基因为KPC 和NDM，与文献[16]报道以NDM 型为主的结果存在差异，其原因可能与菌株来源及地理条件等因素有关[17]。经临床回访，是否检出耐药基因、检出耐药基因数量、是否为单一耐药基因对患者病情转归无显著性差异。

综上所述，CRE 菌株由于具有复杂的耐药机制，常表现为对多种抗菌药物耐药严重，本文基于GeneXpert 技术的快速、准确等特点对CRE 的基因分型和耐药特征进行分析，为全面了解医院CRE 菌株的耐药现状及耐药机制提供了依据。为防止耐药菌株的产生，临床需根据药敏结果合理使用抗菌药物，同时要做好隔离防护和手卫生，以防止耐药株传播流行[18-19]。