雷公藤红素对人子宫内膜癌HHUA 细胞增殖、周期及凋亡的影响

李诗婷，郭玲通讯作者，龚琴琴，蒋泽梅，甘建妮，李俊霞，张永萍，徐剑

(贵州中医药大学药学院制剂实验室，贵州 贵阳)

0 引言

子宫内膜癌是原发于子宫内膜上皮的女性生殖器官恶性肿瘤，其发病率和病死率近来年均有上升趋势[1]。虽然目前针对子宫内膜癌的诊断和治疗手段不断发展，但其总体疗效不佳，病人承受很大痛苦。研究开发疗效更加显著的肿瘤治疗方法仍是医药工作者亟需解决的医学难题之一。雷公藤红素，是从卫矛科植物雷公藤、南蛇藤植物中提取的五环三萜类单体化合物[2]，是雷公藤及其制剂包括雷公藤片、雷公藤多苷片的主要有效活性成分之一。其作为一种天然蛋白酶抑制剂[3]，能有效抑制蛋白酶体活性和诱导细胞凋亡，对前列腺癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]、白血病[7]、胶质瘤[8]、结肠癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11,12]等多种肿瘤细胞均产生了显著的抗肿瘤活性。然而，目前尚未见雷公藤红素用于治疗子宫内膜癌的研究报道。本文拟选择人子宫内膜癌HHUA 细胞为研究对象，考察雷公藤红素对人子宫内膜癌细胞增殖、周期及凋亡的影响，为将其开发为子宫内膜癌治疗药物提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Olympus BX5 型生物显微镜( 日 本Olympus 公 司)；MCO-17AC 型二氧化碳培养箱(日本Sanyo 公司)；YDS-35-125 型液氮罐( 成都液氮容器厂)；BD-100LT 型低温冷冻柜(青岛海尔电冰柜有限公司)；SW-TJ 型水平流净化工作台(苏州市净化设备总厂)；AQZX-C 型空气浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂)；Allegra X-22R 型高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter 公司)；Varioskan Flash 型酶标仪( 美国Thermo Fisher Scientific 公 司)；CytomicsFC500 型 流 式 细 胞仪(美国 Beckman Coulter 公司)。

1.2 药品与试剂

雷公藤红素( 成都普菲德生物科技有限公司，批号：18032109，纯度：＞98.0%)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、核糖核酸酶A(RNAse A)溶液、碘化丙啶(PI)、0.25%胰酶(北京索莱宝科技有限公司)；AnnexinV-FITC/PI 双染试剂盒(美国BD 公司)；1640 培养基、青链霉素双抗(广州吉尼欧生物科技有限公司)；胎牛血清(美国 GIBCO 公司)。

1.3 细胞株

人子宫内膜癌HHUA 细胞株购自广州吉尼欧生物科技有限公司，由本实验室保种。

2 方法

2.1 细胞培养

HHUA 细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素的1640 培养液中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养。用0.25%胰酶消化细胞进行传代，每周约3 次，隔天更换一次培养基，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞增殖实验

采用MTT 法检测雷公藤红素对HHUA 细胞增殖的影响。取对数生长期的HHUA 细胞，计数后按每孔5 000 个细胞接种于96 孔板中，待细胞贴壁长至80%汇合度时，小心弃去培养基，加入不同浓度(0.1、0.4、1.4、6.4、25.6 μg/mL)的雷公藤红素培养基溶液进行干预，每孔200 μL，同时设置空白组(无细胞)和对照组，每组设5 个复孔。培养36 h 后，弃培养液，每孔加入200 μL 含0.5 mg/ mL MTT 的PBS 溶液，继续孵育4 h。中止培养，吸尽孔内培养液，每孔加入200 μL DMSO，将培养板置于37℃±0.5 ℃空气浴振荡器中振摇15 min，使结晶物甲瓒充分溶解。于酶标仪上570 nm 处测定各孔的吸光值A，记录结果。按以下公式计算细胞存活率：

细胞存活率(%)=[(A 加药组-A 空白组)/(A 对照组-A 空白组)]×100%

2.3 细胞周期实验

利用PI 染色法检测雷公藤红素对HHUA 细胞周期分布的影响。取对数生长期的HHUA 细胞，计数后按每孔300 000 个细胞接种于6 孔板中，待细胞贴壁并长至80%汇合度时，弃去培养基，以1.07 4 μg/mL 雷公藤红素处理细胞，同时用培养液作为空白对照组，每组设3 个复孔。培养36 h 后，用胰蛋白酶消化细胞，提取l mL 细胞悬液，于4 °C，2 000 rpm离心5 min，去除上清液后用预冷的75 %乙醇于4 °C 固定30 min，离心去除上清液，用PBS 洗涤，加0.3 mL PBS 重悬后加入0.l mL 0.1%Triton X-100 溶液室温下孵育15 min 进行打孔。孵育后再加入0.1 mL 0.1 mg/mL 的RNaseA 酶，37 °C孵育30 min 降解RNA，然后加入0.2 mL 0.1 mg/mL 的PI 染色DNA，4 °C 孵育30 min 后用流式细胞仪测定各组细胞周期分布情况，并用 ModFit LT 2.0 软件进行分析。

2.4 细胞凋亡实验

采用AnnexinV-FITC/PI 双染法定量评价细胞凋亡情况。取对数生长期的细胞，计数后按每孔300 000 个细胞接种于6 孔板中，待细胞贴壁并长至80% 汇合度时，弃去培养基，加入含雷公藤红素1.07 4 μg/mL 的培养基溶液，同时用培养液作为空白对照组，每组设3 个复孔。加药培养36 h 后，按Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒标准操作步骤进行染色，染色后样品于1 h 内用流式细胞仪检测分析。

3 统计学分析

采用Origin 8.0 软件进行数据分析。数据均以均值±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析、t检验，*P＜0.05 差异具有统计学意义。

4 结果

4.1 雷公藤红素对HHUA 细胞增殖的影响

MTT 结果如图1 所示，雷公藤红素对人子宫内膜癌HHUA 细胞的增殖呈现抑制作用，且具有明显的浓度依赖性。雷公藤红素处理HHUA 细胞36 h 后，细胞存活率的IC50 值为1.07 4 μg/mL，后续实验均在该浓度下进行。

图1 雷公藤红素对HHUA 细胞增殖的影响。(A)不同浓度雷公藤红素处理HHUA 细胞36 h 后，MTT 法测得的细胞存活率结果。(B)雷公藤红素干预HHUA 细胞36 h 的IC50 值。

4.2 雷公藤红素对HHUA 细胞周期的影响

如图2 和表1 所示，雷公藤红素作用HHUA 细胞36 h后，与0 μg/mL雷公藤红素组比较，1.07 4 μg/mL雷公藤红素组G0/G1 期细胞比例显著增加，S 期细胞比例显著减少(P＜0.05)。此外，当用雷公藤红素处理后，药物组不仅将细胞阻滞在G0/G1 期，同时还使得Sub G1 期细胞比例增加。

图2 雷公藤红素对HHUA 细胞周期的影响

4.3 雷公藤红素对HHUA 细胞凋亡的影响

如图3 和表2 所示，雷公藤红素可显著增加细胞早期凋亡和晚期凋亡率。与对照组比较，1.07 4 μg/mL 雷公藤红素处理HHUA 细胞36 h 后，细胞凋亡率均显著增加(P＜0.05)。

图3 雷公藤红素对HHUA 细胞凋亡的影响

表1 雷公藤红素对HHUA 细胞周期的影响 (%，±s，n=3)

表1 雷公藤红素对HHUA 细胞周期的影响 (%，±s，n=3)

注：与0 μg/mL 雷公藤红素组比较，*P＜0.05。

组别 Sub G1 期 G0/G1 期 S 期 G2/M 期0 μg/mL 1.47±0.05 51.63±2.02 31.61±1.63 16.76±1.08 1.07 4 μg/mL 19.51±0.85* 62.73±1.27* 23.11±0.84* 14.16±0.78

表2 雷公藤红素对HHUA 细胞凋亡的影响 (%，±s，n=3)

表2 雷公藤红素对HHUA 细胞凋亡的影响 (%，±s，n=3)

注：与0 μg/mL 雷公藤红素组比较，*P＜0.05。

组别 早凋亡 晚凋亡 总凋亡0 μg/mL 7.4±0.9 2.3±1.0 9.8±2.0 1.07 4 μg/mL 25.2±1.4* 12.7±1.5* 37.9±1.0*

5 讨论

子宫内膜癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20 %-30 %[13]。雷公藤红素是中药雷公藤的主要有效活性成分之一，经查阅文献发现，其不仅在抗炎、免疫抑制、抗神经退行性疾病等[14]领域显示了良好的药理活性，还在治疗肿瘤等方面展示了其潜力，极具开发价值。研究发现雷公藤红素对体外培养的女性生殖系统恶性肿瘤细胞包括宫颈癌细胞[15]和卵巢癌细胞[16]均有较强的抑制作用，并能诱导细胞凋亡。但雷公藤红素对于子宫内膜癌的抗肿瘤作用至今尚未见报道。本实验研究雷公藤红素对子宫内膜癌细胞株HHUA 细胞的作用，探究临床应用雷公藤红素治疗子宫内膜癌的可行性。

本实验通过MTT 法观察了不同浓度的雷公藤红素(0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 μg/mL)对人子宫内膜癌细胞株HHUA 的生长抑制情况，并与空白对照组进行比较，发现雷公藤红素对HHUA 细胞的增殖呈现抑制作用，且具有明显的浓度依赖性，在一定的浓度范围内随着药物浓度的增加，抑制作用也显著增加。

癌细胞的细胞周期处于失控状态，这是癌细胞可以无限增殖的原因之一，抗肿瘤药物可通过阻滞细胞周期抑制肿瘤生长[17]。雷公藤红素可将HHUA 细胞周期相对阻滞在G0/G1 期，使G0/G1 期细胞比例显著增加，S 期细胞比例显著减少。此外雷公藤红素还使Sub G1 期细胞显著增多，Sub G1期代表亚二倍体DNA 的含量，象征着细胞凋亡，说明雷公藤红素不仅产生了细胞周期阻滞作用，还诱导了子宫内膜癌细胞发生凋亡。因此，本课题进一步采用AnnexinV-FITC/PI 双染检测细胞凋亡情况。实验结果表明，与对照组比较，1.07 4 μg/mL 雷公藤红素干预HHUA 细胞36 h 后，HHUA 细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著增加(P＜0.05)。

综上所述，本研究首次探索了雷公藤红素对人子宫内膜癌HHUA 细胞的抗肿瘤作用，结果发现其体外抗肿瘤作用明显，雷公藤红素可能通过干扰细胞周期，诱导细胞凋亡进而抑制HHUA 细胞的增殖生长。后期笔者将建立动物模型，结合体内、体外实验进一步深入探索雷公藤红素对子宫内膜癌的治疗作用，并探究雷公藤红素阻滞细胞周期以及诱导细胞凋亡的分子机制，为其临床应用奠定一定实验基础。