针刺调节Ghrelin对高血压大鼠血管内皮损伤保护机制研究*

张晨新,曲 怡,王建波,张立德

(辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心，辽宁 沈阳 110847)

作为心脑血管疾病中发病率及死亡率极高的病种，原发性高血压在临床上的发病率呈现逐年增高的趋势，因高血压引起的心、脑和肾的靶器官损伤已经成为威胁正常人体健康的重要因素之一[1]。血压的异常增高而导致的微血管损伤是高血压靶器官主要发病机制。近年来，血管内皮损伤是高血压疾病的主要研究热点[2]，寻找能逆转血管内皮功能的治疗方式对于逆转高血压靶器官损伤有着重要意义。既往对Ghrelin研究均集中于调节胃肠激素分泌、增强胃黏膜防御、调节胃动力功能和增强胃运动活动等方面[3-5]，然而Ghrelin对于血管内皮的保护作用鲜有报道。最新研究表明Ghrelin与血压密切相关，GHSR在心脏、肾脏和血管中的高表达为Ghrelin在血压调节提供了证据，Ghrelin浓度与血压呈负相关[6]。因此，调节Ghrelin浓度对保护高血压内皮功能具有重要的意义。

足三里具有显著降压效果，临床Meta分析文献证实，常用降压穴位中，足三里的使用频次高达30.6%[7]。中医将高血压归属为“眩晕”“头痛”“不寐”等范畴，其针刺治疗依据中医辨证论治选穴配方。足三里为足阳明胃经穴位，阳明经属多气多血之经，而足三里作为“合穴”“合主逆气而泄”，针刺足三里具有“泄气血”之功。因此，在临床采用针灸治疗高血压配穴时，常选用该穴，并达到了良好的治疗效果。本实验拟从胃动力密切相关Ghrelin入手探讨针刺足三里调节Ghrelin保护内皮细胞的作用，部分阐释了足三里“泄”的机理，为临床针刺降压提供实验依据。对丰富中医内涵、拓宽临床医生诊疗思维具有重要意义。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SHR大鼠30只、WKY大鼠10只，大鼠体质量在(200±10 g)左右[许可证号：SCXK(京)2019-0011]。动物购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。本实验在辽宁中医药大学动物实验中心进行，实验过程中严格按照无菌操作标准，保障大鼠SPF级生存环境。

1.2 主要仪器

华佗牌针灸针(0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；ABI Veriti梯度PCR仪(Applied Biosystems)；超微量紫外分光光度计(Thermo，nano-drop 2000)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)；SpectraMax i3多功能酶标仪(奥地利)；VE-386半干转移电泳槽(上海天能)；EPS-600电泳仪(上海天能)；VE-180垂直电泳槽(上海天能)；数码凝胶图像处理系统(上海天能)。

1.3 主要试剂

ET-1 E1isa试剂盒(Bejing Cheng Lin Biological Technology Co.，Lot.201905)；Ghrelin E1isa试剂盒(Bejing Cheng Lin Biological Technology Co.，Lot.201905)；PCR反转试剂盒(康为世纪，Lot 40326)；PCR扩增试剂盒(康为世纪，Lot 60407)；Trizol总RNA抽提试剂(Beyotime，Lot R0061)；PCR引物(博迈德引物合成公司)；DEPC水配制，0.2mL DEPC与200 mL超纯水混合，分装后过夜，高压灭菌；RIPA组织/细胞裂解液(Solarbio，Lot.No.20190418)；PMSF(Solarbio，Lot.No.20190505)；PVDF膜(Membrane，Lot.K5EA7920A)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime Lot No.P0012S)；SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒(Beyotime，Cat No.P0012AC)；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(凯基生物，Lot No.051319190513)；Marker(凯基生物，Lot.20171113)；β-actin Mouse Monoclonal Antibody(Absci，Lot.5814)；GHS-R1 antibody(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，Lot.L0214)；eN0S Mouse Monoclonal Antibody(Abcam，Lot.4023); HRP*Goat Anti-Mouse IgG(Immuno Way，Catalog No:RS0001)；HRP*Goat Anti -Rabbit IgG(ImmunoWay，Catalog No:RS0002)；HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(E030120-01)；ECL (Beyotime，Lot:P0018S)；引物合成(北京博迈德基因技术有限公司)。

2 方法

2.1 分组和造模

选用雄性SHR大鼠30只，随机数字表法分为模型组(10只)、针刺组(10只)和非经非穴组(10只)，WKY大鼠(10只)作为空白组。SHR大鼠收缩压均>150 mmHg。

2.2 取穴与针刺方法

针刺组选取大鼠双侧足三里穴(穴位定位参考《实验针灸学》)进行针刺治疗[8-9]，用0.25 mm×13 mm毫针针刺“足三里”穴，穴位位于大鼠双侧膝关节外侧、腓骨小头下3.5 mm处；非经非穴组针刺鼠尾作为非经非穴点，以毫针直刺5 mm即可。针刺疗程共7 d。

2.3 取材

大鼠在针刺结束后，禁食24 h，禁食期间自由饮水，然后进行取材工作。按照大鼠体质量注射10%水合氯醛麻醉，麻醉剂量为0.3 mL/100 g。大鼠麻醉后，腹主动脉取血，离心取血清，将血清置于-20℃冰箱保存备用。取血结束后，剔出胸主动脉组织于无菌EP管中，冻存备用。

2.4 观察指标及检测方法

2.4.1 荧光定量PCR检测GHSR、eNOS mRNA表达 取大鼠主动脉组织100 mg，用Trizol法萃取提取mRNA。经过浓度与纯度测定后，调整mRNA浓度进行逆转录反应，将mRNA反转为cDNA并用ROX荧光体系进行扩增，反应总体系为20 μL(扩增条件：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40个循环)。扩增使用PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

2.4.2 使用Elisa法检测ET-1、Ghrelin浓度 取主动脉组织100 mg，加入1 mL PBS与研磨珠进行匀浆(3 000 r，15 min)。离心后收取上清液。在96孔板上设置好空白孔、标准品孔以及待测样品孔。不同孔分别加入不同浓度的标准品以及待测样品各50 μL；每孔加入50 μL酶标试剂，封口孵育30 min；洗涤后加入显色剂A，B各50 μL，封口封口孵育30 min；加入终止液50 μL，用酶标仪测定每孔OD值(450 nm波长)；用标准孔数值绘制y=ax+b回归线，用公式计算主动脉ET-1、Ghrelin浓度。

2.4.3 Western Blot检测不同组别大鼠主动脉eNOS、GHSR蛋白表达 取胸主动脉组织100 mg，加入1 mL RIPA裂解液进行匀浆，离心取上清液。用BCA法测定上清液中总蛋白浓度并进行浓度调整。配置凝胶进行电泳，每孔上样50 μg进行电泳。电泳结束后用半干转的方式进行转膜，将蛋白质转移到0.22的PVDF膜上。封闭37 ℃，1 h；加入一抗，4 ℃过夜；TBST清洗；加入二抗，37 ℃ 1 h；TBST清洗。加入ECL发光液，在数码凝胶成像系统进行检测。分析条带灰度值进行数据统计。

2.5 统计学处理

统计分析采用SPSS 21.0进行数据分析。统计结果数据采用均数±标准差表示。组间分析使用单因素方差分析的统计分析方法，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同组别大鼠主动脉组织GHSR、eNOSmRNA表达比较

由表2、图1可知，与空白组比较，模型组和非经非穴组大鼠主动脉组织GHSR、eNOS mRNA表达明显下调(P<0.05)；与模型组相比，针刺组大鼠主动脉组织GHSR、eNOS mRNA表达显著上调(P<0.05)，非经非穴组差异无统计学意义(P<0.05)。

表2 不同组别大鼠胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达变化比较

图1 不同组别大鼠胸主动脉GHSR、eNOS mRNA溶解与扩增曲线

3.2 不同组别大鼠血清ET-1、Ghrelin表达

由表3可见，模型组、针刺组和非经非穴组大鼠主动脉组织ET-1、Ghrelin含量与空白组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；针刺组主动脉组织ET-1、Ghrelin含量与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。非经非穴组主动脉组织ET-1、Ghrelin含量与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 不同组别大鼠血清ET-1、Ghrelin表达变化比较

3.3 不同组别大鼠胸主动脉eNOS、GHSR表达

各组大鼠主动脉组织的蛋白表达比较由图2、表4可知，与空白组相比，模型组和非经非穴组大鼠主动脉组织eNOS、GHSR蛋白表达明显下调(P<0.05)；与模型组相比，针刺组大鼠主动脉组织eNOS、GHSR蛋白表达显著上调(P<0.05)，非经非穴组差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 不同组别大鼠胸主动脉eNOS、GHSR灰度值变化

图2 不同组别大鼠胸主动脉eNOS、GHSR表达

4 讨论

原发性高血压是由于遗传、环境等多种因素相互作用，导致体循环动脉压增高的一种疾病[10]。在高血压的发生发展过程中，可以造成心、脑、肾和循环系统等器官的损害，且高血压是最常见的心血管疾病之一。目前研究表明,高血压发病的主要原因是全身细小动脉的持续性痉挛硬化，导致全身循环阻力增加，从而引起血压上升,而心血管疾病的一个早期病理改变即为血管内皮功能受损[11]，原发性高血压发病的重要机制之一就是血管内皮功能障碍。主动脉内皮属于血液与血管平滑肌之间的一层屏障，能够有效地抵抗炎症物质入侵，阻碍脂质物质沉淀，另外内皮还可以释放NO维持血管舒缩功能的稳态。当高血压病内皮功能受到损害，内皮完整性受到破坏的时候，会引起心血管重塑和动脉粥样硬化等疾病，大多数学者认为诱发许多心脑血管疾病的共同环节是由内皮细胞结构损伤与功能紊乱导致。血管内皮功能的重要性使其成为心血管疾病的1个基本靶点和调节点，血液的流动性和抗血栓形成功能依赖于内皮功能的完整性。内皮释放的体液因子可以控制纤维蛋白溶解和血栓形成、血小板激活和抑制、血管舒张和收缩，内皮细胞释放的缩血管物质主要有ET-1、血栓素A2(TXA2)和血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)，NO、前列环素(PGI2)是内皮细胞主要释放的扩血管物质。这些血管活性物质的水平直接反映了内皮功能是否正常。

Ghrelin是一种主要由胃和小肠产生的含28个氨基酸的多肽[12]，是生长激素分泌激素受体(GHSR)的内源性配体，GHSR在心脏、肾脏和血管中均有表达[13]，Ghrelin主要是由X/A样细胞产生，通过旁分泌的方式进入血液循环[14]，Ghrelin及其受体在人类微血管内皮细胞中有表达，Ghrelin亦可改善血管内皮功能， 抑制炎症因子[15]。GHSR对心血管系统有保护作用，这也间接证明了Ghrelin在高血压发病机制和血压调节上起到了关键的作用。体外研究表明Ghrelin能通过抑制ET-1的分泌、增加eNOS的合成，促进NO的释放，引起血管的舒张[16]。Ghrelin亦可通过降低eNOS的表达直接诱导NO的合成扩张血管来保护血管内皮功能、降低血压[17]。Ghrelin可以激活内皮或者直接作用于血管平滑肌，导致血管舒张、降低血压[18]。本研究结果证实，模型组大鼠与空白组相比血清中Ghrelin、ET-1的含量升高，胸主动脉GHSR、eNOS mRNA表达下降，胸主动脉eNOS、Ghrelin蛋白量下降，说明Ghrelin水平与高血压血管内皮功能密切相关。

中医学无高血压这一病名，常将此病归属于“眩晕”“头痛”的范畴。目前本病主要以药物治疗为主， 针灸作为非药物疗法具有毒副作用小、操作简便的特点，且对原发性高血压病疗效确切，并且广泛应用于临床。但其机制尚不清楚，本研究采用多气多血的阳明经穴位足三里进行针刺治疗，研究该针刺组穴对于血管内皮的生理机能产生的影响，以期发现针刺治疗肥胖性高血压的作用靶点与机制。高血压是由于阴阳失调、气机运行异常和脏腑经络等功能失调引起，以血压升高作为可以监测的临床症状体征，并伴随着头晕、头痛等临床表现。而这些症状大多是由于脑小动脉痉挛，这种动脉痉挛又与高血压息息相关，动脉痉挛继而发生脑动脉硬化、脑供血不足等病理改变，会使患者病情更为严重。高血压的中医病因病机应从血脉论治，且多数医家认为内皮功能障碍应从“心主血脉”论治。足三里首见于《灵枢·本输》，归属足阳明胃经，为胃经合穴，又为胃腑之下合穴，具有调和气血、补益中气和健脾和胃的作用。足三里穴作为主穴用于高血压病能有效地降低高血压大鼠的血压，而对心率无影响。多数医者认为针刺足三里对正常的血压无降低作用，只是对异常升高的血压有降低效用，此降压作用是由于外周血管的扩张所致。因此，本实验选取此穴作为降压治疗的主穴。针刺足三里可以达到平稳、安全降压的目的，降低了高血压病对靶器官损害的风险，预防心脑血管事件的发生。同时，现代临床最常用于降压的经验穴之一就是胃经合穴足三里[19]。研究表明针刺足三里可以通过调节内皮细胞分泌功能从而达到降低血压的目的[20]。本研究结果显示，针刺足三里能明显改善SHR大鼠血清Ghrelin、ET-1水平和胸主动脉GHSR、eNOS mRNA及eNOS和GHSR的蛋白表达，针刺足三里可能通过调节Ghrelin和血管内皮活性物质水平来保护SHR大鼠血管内皮功能。以上研究通过探索针刺干预保护血管的通路，揭示了部分针刺足三里治疗原发性高血压的作用靶点，也为Ghrelin在血管内皮损伤中的作用提供了一定依据，一定程度上解释了针刺足三里对高血压机体的保护作用机制。从实验方面研究针刺对原发性高血压的防治不仅为高血压的针刺治疗提供了有力的证据，还对减缓高血压人群的疾病进程以及提高患者生活质量有重大意义。