电针对抑郁模型大鼠海马及外周血清BNDF、5-羟色胺的影响*

许艺元，李志刚，王巧侠，秦萍萍，刘潇潇

(北京中医药大学，北京 100029)

抑郁症是一种长时间的持久性情绪低落，伴失眠焦虑甚至出现自杀倾向的精神疾患[1]。目前对抑郁症的研究仍停留在假说阶段，其中神经营养因子假说和神经递质假说和基因转录假说占有重要地位[2]。慢性应激是诱导抑郁发生的主要原因，而海马作为应激递质分泌的靶区域，是参与应激反应的最重要脑区之一[3]。本实验选取大鼠海马内脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)及5-羟色胺(5- hydroxy tryptamine，5-TH)作为研究指标，通过建立抑郁模型，观测电针前后大鼠的行为学变化以及海马内BDNF、5-TH的影响，从而探索电针对抑郁症的治疗机制及影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 免疫组化相关试剂与仪器 无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);二甲苯(国药集团化学试剂有限公司);EDTA抗原修复液(武汉博士德生物工程有限公司);双氧水(国药集团化学试剂有限公司);牛血清白蛋白V(北京索莱宝生物公司);PBS(武汉博士德生物工程有限公司);DAB显色剂(武汉博士德生物工程有限公司);BDNF一抗(ab108319，美国abcam公司);5-HT一抗(ab66047，美国abcam公司);脱水机(JT-12S，武汉俊杰电子有限公司);包埋机(JB-P7，武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(RM2235，德国徕卡);冻台(JB-L7，武汉俊杰电子有限公司);烤片机(DB-B2，常州国华电器有限公司);烤箱[101-1BS，邦西仪器科技(上海)有限公司];摇床(SK-R1807-E，美国赛洛捷克);混匀仪(MX-S，美国赛洛捷克);倒置显微镜(Nikon Ci-S，日本尼康);成像系统(Nikon DS-U3，日本尼康)。

1.1.2 ELISA相关试剂与仪器 大鼠BDNF ELISA 检测试剂盒(MB-1750A，江苏酶标生物);5-HT ELISA检测试剂盒(MB-1983A，江苏酶标生物);超净台(SW-CJ-2，江苏苏州); 微量加样器(Refe-rence，德国 eppendorf);微量振荡器(MH-2，上海楚柏);烘箱(Venticell，德国MMM);酶标仪(EXL800，美国Bio-Tek)。

1.2 实验动物

SPF级健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，体质量300～350 g，实验环境相对室温(23±1)℃，相对湿度(50±5)%，自然昼夜节律光照，标准饲料，自由饮水摄食，12 h白天-黑夜循环饲养。

1.3 模型建立

采用慢性不可预知应激刺激结合孤养的方式，防止大鼠对一种或多种规律的应激刺激产生耐受性。正常组采取群养，其他各组采取孤养，并进行21 d每天随机8种不同的应激刺激，包括4℃冷水游泳5 min、昼夜颠倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夹尾3 min、水平摇晃30 min、笼位倾斜45° 24 h和潮湿环境24 h等刺激，平均每种刺激3次。

1.4 动物分组

清洁、健康级雄性SD大鼠32只根据随机数字表法随机分为4组：正常对照组、模型组、电针组和药物组，每组各8只。

1.5 各组饲养及干预方法

1.5.1 正常组 群养，正常饲养，不接受任何刺激。

1.5.2 模型组 孤养，接受慢性应激处理21 d，不给予任何治疗性刺激及抗抑郁剂。

1.5.3 电针组 孤养，接受慢性应激处理21 d。每日于应激刺激1 h后将大鼠置于自制鼠套(前半部透明网纱，后半部黑色)内进行电针治疗。电针治疗方法：治疗采用一次性针灸针(0.30 mm×25 mm，华佗牌，苏州针灸器械厂)进行针刺，穴位选用百会穴(GV20)、印堂穴(GV29)与双侧内关穴(PC6)，穴位定位参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》。针刺GV20时，针尖朝向大鼠后头部斜刺2 mm，针刺GV29针尖向鼻尖方向斜刺5 mm ，实验中为避免因两针位置太近针柄相接而短路，于两针柄间放置消毒脱脂棉球。针刺完成后分别于双侧PC6间、GV20与GV29间接韩氏穴位神经刺激仪，电针频率2/100 Hz，电流强度为1 mA，以动物肢体微颤为度，每次治疗持续20 min。

1.5.4 药物组 孤养，接受慢性应激处理21 d，每日于应激刺激1 h后予百优解灌胃(剂量：2 mg/kg，1次/d，生理盐水1 mL稀释)。

1.6 高架十字迷宫测试

大鼠每组8只，21 d造模后做行为学检测。自制高架十字迷宫(High plus maze，HPM)：由两条相对开放臂(50 cm×10 cm)和两条相对闭合臂(50 cm×10 cm，臂两侧有40 cm高挡板)及中央区(10 cm×10 cm)连接而成，离地高70 cm。将大鼠放入十字迷宫的中央格，保持向闭合臂，记录5 min内大鼠的活动情况。观察大鼠进入开放臂的次数以及在开放臂的停留时间、闭合臂的进入次数及闭合臂停留时间；计算比较各组大鼠在开放臂的停留时间及进入次数的百分比。开放臂停留时间百分比为大鼠在开放臂停留时间与在开放臂和闭合臂停留的总时长之比；开放臂进入次数比为大鼠进入开放臂次数与进入开放臂和闭合臂的总次数之比。

1.7 酶联免疫吸附法检测

高十字架迷宫测试后，在各组大鼠中随机抽取6只，10%水合氯醛富强麻醉。腹主动脉采血，室温静止1～2 h，4200 rmp离心10 min，取上清，-80℃保存，备用。按照检测BDNF及5-TH 的 ELISA 试剂盒说明书进行操作，于波长450 nm酶标仪上读值，以OD值为横坐标，纵坐标为样品浓度，以此绘制出标准曲线。并根据血清样品的OD值，在标准曲线上查出其对应的浓度。

1.8 免疫组织化学检测

各组动物快速断头取脑，去除颅骨，充分暴露脑组织，快速剥离海马组织，放入4%多聚甲醛液中固定，经脱水、透明、石蜡包埋和热修复，免疫组化备用。BDNF及5-TH的测定采用免疫组化SP法。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作，每张切片随机选择3个视野，之后计算每高倍镜(200×)下积分光密度值(Integral optical density，IOD)。BDNF的阳性反应产物主要集中在胞质及核膜周围区域，呈棕黄色丝状物；5-TH则主要在神经元包质包膜着色，呈黄褐色。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 高架十字迷宫实验结果

高架十字迷宫是国际上公认的经典测量焦虑反应的方法，大鼠进入开放臂次数及在开放臂的停留时间与其焦虑情绪成负相关[4]。如表1所示，与正常组相比，模型组大鼠进入开放臂次数比及处于开放臂时间比明显降低，组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠焦虑行为明显强于正常组，提示抑郁模型造模成功。与模型组相比，药物组和电针组进入开放臂次数比及时间比明显升高，组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)。说明用电针、药物进行干预后，大鼠的焦虑症状明显改善。与药物组相比，电针组大鼠进入开放臂次数比更高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，说明电针在改善大鼠抑郁焦虑行为症状时，一定程度上优于药物组。

表1 高架十字迷宫中行为学检测结果

2.2 电针对外周血与海马中BDNF和5-TH含量的影响

ELISA结果显示，模型组外周血中BDNF、5-HT含量明显低于正常组，组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)。药物组和电针组BDNF、5-HT含量明显高于模型组，组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组海马BDNF、5-HT表达明显降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，药物组和电针组BDNF、5-TH表达均明显升高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。与药物组相比，电针组中BDNF与5-HT的表达都稍高，一定程度表明电针对于抑郁模型大鼠的治疗效果更加显著。见表3、图1和图2。

表2 各组大鼠外周血清中BDNF与5-HT含量结果

表3 各组大鼠海马中BDNF与5-HT表达结果

图1 各组大鼠海马组织BDNF表达(免疫组化，200×)

图2 各组大鼠海马组织5-TH表达(免疫组化，200×)

3 讨论

抑郁症在中医学中与“郁证”“梅核气”“癫证”“脏躁”等病症相关。其作为一种神经系统疾病，作用机制较为复杂，且临床药物治疗也面临着副作用大等问题。多名学者研究显示：针刺治疗抑郁症具有实施方便、适用患者群体广泛、副作用小、安全度高与成本低等优势[5-9]。本实验选取电针疗法以增强毫针针刺的刺激量并最大限度地减小由施针者不同或同一施针者不同情态下施针而造成的误差。其基于针灸的经络腧穴理论，从整体上疏通经络，促进气血运行，以促进患者自身阴阳平衡，从而治愈抑郁症导致的一系列症状；且电针治疗在改善抑郁患者生理症状的同时，注重调整其内在精神情绪状态，达到双管齐下的目的。

BDNF广泛分布于中枢神经系统内，作为神经营养因子假说中的重要研究成分，可调节神经功能及可塑性，尤其是对海马的神经发生具有极其重要的促进作用[10]。Taliaz D等[11]学者认为 BDNF 的减少可使海马体积缩小，海马内神经元及周围胶质细胞减少。

5-TH主要分布在中脑中缝核群，是中枢神经系统分泌的重要神经递质，参与神经元的分化与再生[12]。Ferraro G等[13]学者认为，反复持续应激刺激可引起海马结构发生改变，造成海马神经元的缺失，抑制中缝核内5-TH、DA等神经递质的释放，出现抑郁症状。

通过本实验，发现抑郁症发病与治疗过程中大鼠海马与外周血清当中BDNF与5-HT的含量变化一致，且无明显变化幅度的差异，据此可以猜测BDNF与5-TH两个途径具有某种相关性。

电针可对BDNF及5-TH两个系统均产生良性干预，由此可印证电针对抑郁症具有多层次、多靶点的综合调节作用，且因其具有良好的耐受性、安全性等特点，为抑郁症的临床治疗方案提供了新的选择。今后笔者将继续探索BDNF与5-HT两条通路的具体联系以及电针对抑郁大鼠模型的时效性。