无创产前基因检测对血清学筛查临界风险孕妇的检测效能

王奕霞 彭海山 李怡 杨洁霞 侯亚萍 郭芳芳 欧阳浩新 王东梅

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511442)

我国每年新增约90万例出生缺陷儿，染色体异常是导致出生缺陷的最常见因素，最常见的染色体异常主要包括21-三体、18-三体、13-三体和性染色体异常，每年新增的缺陷儿已经成为影响我国人口素质及群体健康水平的公共卫生问题[1,2]。在无创产前基因检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)进入临床应用之前，预防出生缺陷主要靠血清学筛查和介入性产前诊断等，但血清学的漏诊率(20%～40%)和假阳性(5%)很高[3]，而介入性产前诊断虽是金标准但又具有很大的风险(如宫内感染、流产等)，且有部分患者存在一定的禁忌证(发热、先兆流产、出血倾向以及感染未愈)而不适用。无创产前基因检测是抽取孕妇外周血检测游离胎儿DNA的技术，其特点具有快速，无创伤性，安全性高，不会对胎儿和孕妇造成任何风险，且经国内外研究证实具有很高的灵敏度和特异度，可高达99%[4，5]，因此NIPT作为产前筛查的手段受到了广大孕妇的青睐，特别是对于血清学筛查临界风险的孕妇来说是一个不错的选择，可以有效地降低介入性产前诊断带来的风险，并提高产前筛查的效能。本研究通过选取12 342例血清学筛查临界风险的病例，采用高通量基因测序技术分析孕妇外周血胎儿游离DNA，对NIPT提示高风险的孕妇进一步行产前诊断，并对所有纳入病例进行妊娠结局随访，探讨无创产前基因筛查对于血清学筛查临界风险孕妇的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 基本资料 选取了12 342例于2015年1月至2019年12月就诊于广东省妇幼保健院，血清学筛查临界风险的单胎孕妇(孕12～38周，年龄15～47岁)，自愿接受NIPT检测。所有孕妇符合孕期不合并恶性肿瘤、一年内没有异体输血、移植手术和细胞治疗、夫妇均没明确的染色体异常。检测前把适应证、局限性及可能存在的风险告知孕妇，孕妇充分知情同意后签署知情同意书。NIPT提示高风险的孕妇进一步行产前诊断，并对所有纳入研究范围的孕妇进行随访，本研究符合伦理标准并通过医院医学伦理委员会的批准。

1.2 检测方法

1.2.1 早中期血清学筛查 采用PerkinElmer公司DELFLA-1235型全自动时间荧光分辨仪及检测试剂盒对孕妇外周血进行检测：①孕早期(9～13+6周)采用血清学标志物(PAPPA+游离β-HCG+NT)评估风险；②孕中期(15～20+6周)采用血清学标志物(AFP+游离β-Hcg+uE3)评估风险。根据血清学筛查结果，并结合孕妇体重、年龄、孕周等因素通过唐氏综合征风险评估软件“LifeCycle4.0”评估风险。21-三体的临界风险值介于1/1000～1/250，18-三体临界风险值介于 1/1000～1/350。

1.2.2 无创产前基因检测流程 采集孕妇外周血于EDTA抗凝管或游离核酸采样管，前者4℃保存，8h内分离血浆，后者放置室温，3天内分离血浆。①分离后的血浆用tianLong核酸提取仪和磁珠法游离核酸DNA提取试剂盒提取DNA；② Biomek4000全自动化工作站和博奥晶芯测序试剂盒构建文库、文库定量等操作，具体操作严格按照仪器和试剂盒说明书进行；③将待测文库混合后在Proton 高通量测序平台检测；④测序后，通过序列的比对、拼接等生物信息学处理，对不同染色体水平进行统计，识别胎儿染色体是否有异常，并通过统计学公式得出胎儿患染色体非整倍体或拷贝数变异的风险。

2.3 染色体核型分析和随访 NIPT提示高风险的孕妇，充分告知孕妇各种方法的局限性，可能存在的风险，经孕妇知情同意后，抽取羊水或脐血进行染色体核型分析或者染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)检测。对所有纳入标准的孕妇进行电话随访或者病例查询，高风险孕妇随访至有妊娠结局出现，低风险孕妇则随访至新生儿出生后，随访率100%。

2.4 统计学处理 所有计数资料用频数和频率表示。无创结果和核型或 CMA 结果比较则通过阳性预测值(positive predictive value，PPV)、灵敏度、特异度、假阳性率进行评估。PPV=真阳性病例数/(真阳性病例+假阳性病例)；灵敏度=真阳性病例数/(真阳性病例数+假阴性病例数)；特异度=真阴性病例数/(真阴性病例数+假阳性病例数)；假阳性率=假阳性病例数/(假阳性病例+真阴性病例)。

3 结果

3.1 不同年龄组的分布情况 本研究血清学临界风险病例共12 342例，经孕妇知情同意，自行选择进行NIPT检测，检测成功率100%。NIPT提示高风险共74例，阳性率为0.60%(74/12 342)。其中<35岁组检出56例，检出率0.56%(56/10 043)；≥35岁组检出18例，检出率0.78%(18/2299),具体分布情况见表1。

表1 不同年龄组的分布情况

3.2 NIPT高风险孕妇核型结果分析 74例NIPT高风险孕妇，经知情同意，签署知情同意书，均进行介入性产前诊断，其中21-三体高风险28例，确诊20例，阳性预测值为71.43%；18-三体高风险3例，确诊1例，阳性预测值为 33.33%；13-三体高风险10例，确诊4例，阳性预测值40.00%。性染色体异常22例，确诊5例，阳性预测22.73%。缺失/重复共11例，确诊4例，阳性预测值36.36%。高风险结果以21-三体高风险占较大，占37.84%(28/74)，NIPT检测结果低风险孕妇通过电话或者病例查询随访至新生儿出生，均未发现阳性结果。NIPT对血清学临界风险孕妇的检测效能见表2。

表2 NIPT对血清学临界风险的检测效能

4 讨论

随着经济发展医疗教育水平的提高,人们对于预防出生缺陷，优生优育的意识也越来越强。常见的21-三体、18-三体、13-三体染色体非整倍体是导致新生儿出生缺陷的重要原因之一[1]。而目前临床上缺乏有效治疗手段，需要及时通过产前筛查和产前诊断的检测，避免缺陷儿的出生。

随着技术的发展革新,基于胎儿游离DNA的高通量测序技术因其是一种无创、快捷、安全有效的筛查方法而倍受孕妇关注。经过近十年的数据积累，国际上对NIPT检测 21-三体、18-三体及 13-三体综合征的准确性和特异性在临床应用中的价值已获得高度认可[6，7]。传统血清学筛查的准确率只有60%～70%[8]，极易错筛漏筛。介入性产前诊断虽准确度高，但国内外文献显示，行有创产前诊断的孕妇约2%被确诊胎儿染色体异常，可因羊水穿刺或绒毛取样造成的胎儿相关并发症却高达0.5%～1.0%[9]，因此会引起部分孕妇的抵触心理，对于有流产、传染病和感染风险等孕妇也不适用有创产前诊断。此外，随着二孩政策的开放，孕妇数量增加，侵入性产前诊断技术因检测时间长，技术要求高，检测通量低，已远远不能满足临床的需求，因此NIPT的问世，弥补了目前临床筛查的部分缺陷，为孕妇提供了多一个选择。

本研究中，12 342例血清学临界风险病例中，年龄<35岁共10 043例，占了81.37%，26例确诊为胎儿染色体异常。在NIPT问世之前，血清学筛查临界风险孕妇需做有创性产前诊断明确是否染色体异常，而本组人群中只有26例为染色体异常者，因此无创基因检测的出现大大降低了穿刺率。另外一组年龄≥35岁以上共2299例，占了18.63%，8例确诊为胎儿染色体异常,若按我国母婴保健法规定，凡是年龄≥35岁的产妇都建议进行产前诊断，2299例孕妇都需要选择羊水或脐血穿刺，出现过度诊断的现象。同时因介入性产前诊断的创伤性，有可能会发生早产，宫内感染，流产等风险，致使部分孕妇产生恐惧心理，不愿检测，以致没能及时诊断，导致异常胎儿的出生，给家庭和社会带来巨大负担。有学者研究显示血清学筛查临界风险是选择无创产前筛查最常见的指证[4, 10],而该群体往往是染色体异常最容易漏诊的人群[11]。故无创产前基因检测技术作为二线的筛查方法，能更准确地检测出染色体非整倍体，为血清学临界风险孕妇提供了一个很好的选择，可以减少有创产前诊断数量，缓解了她们因可能要面临介入性产前诊断而产生的心理压力。

随着NIPT在临床中的发展应用，NIPT的检测谱也在增加，但主要用于检测21-三体、18-三体、13-三体综合征。本研究中NIPT检测结果提示高风险74例，常见染色体非整倍体(21-三体、18-三体、13-三体综合征)占了55.41%(41/74)，复合PPV为60.98%。NIPT诊断21-三体、18-三体、13-三体综合征的灵敏度均为100%，阳性预测值分别为 71.43%、33.33%、40.00%。彭海山等[10]研究显示，21-、18-、13-三体综合征的灵敏度为 100%、91.67%、100.00%，阳性预测则为88.06%、78.57%、33.33%；罗丽双等[11]报道了5756例孕妇NIPT的21-三体、13-三体、18-三体综合征及性染色体异常的阳性预测分别为 86%、40%、25%。本研究与国内一些研究者对NIPT在常见染色体非整倍体的诊断效能评价比较，结果相近。18-三体、13-三体阳性预测较低，可能与本研究样本例数少有关，但其灵敏度均可达100%，特异度分别为99.94%、99.98%、99.95%。由此可知，NIPT 对 21-三体、18-三体、13-三体综合征在不同人群中都能很好的筛检出，可成为血清学临界风险人群孕检的一线筛查手段。另外本研究还分析了NIPT对性染色体异常筛查的灵敏度为100%，特异度为 99.86%，PPV为 22.73%；对染色体缺失/重复筛查的灵敏度为100%，特异度为99.94%，PPV为36.36%。NIPT可一定程度上检测性染色体异常和染色体缺失/重复，在非目标筛查疾病中也有一定的应用价值。

虽然NIPT的准确性高，但也存在假阳性和假阴性的局限。本研究中NIPT高风险者中有40例染色体核型分析未见异常，其合计假阳性率为0.32%，因此NIPT仅可作为高精确度的筛查方法，在临床工作中应做好NIPT检测前和检测后的咨询工作。当NIPT提示相关染色体异常时，后续需要结合B超排查胎儿畸形风险，进一步行介入性产前诊断，通过染色体核型和CMA确诊。

综上所述，NIPT的临床应用对于血清学筛查临界风险孕妇具有很好的检测效能，降低血清学临界风险孕妇的穿刺率，降低出生缺陷的发生。NIPT是血清学产前检测技术的必要补充手段，在临床工作还要做好NIPT检测前后的咨询工作。今后，对于如何提高非目标染色体预测的准确度，是我们的研究重点。