呋喃唑酮代谢物在中华绒螯蟹体内消除规律

黄宣运，沈晓盛，史永富，蔡友琼

（中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部水产品质量安全与风险评估实验室（上海），上海 200090）

呋喃唑酮（furazolidone）又名痢特灵，是一种人工合成的硝基呋喃类广谱抗生素，通过干扰细菌氧化还原酶起到杀菌作用［1］，可用于水产动物胃肠道疾病的预防与治疗［2］。从1993年开始，欧盟最先禁止在动物养殖过程中使用呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因等硝基呋喃类药物，主要原因是它们的代谢物具有潜在的致突变和致癌风险［3］。研究表明，呋喃唑酮在动物体内可迅速代谢为3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ），且可较长时间残留在动物体内［4］。欧盟规定硝基呋喃类代谢物在水产品中的最低要求执行限为1.0 μg·kg-1［5］。我国规定水产品动物中不得检出硝基呋喃类代谢物［6］，目前的判定依据与欧盟一致。

虽然硝基呋喃类药物属于禁用药物，但违规使用现象仍时有发生［7］，鉴于监管和风险评估的需要，已在罗非鱼［8-9］、海参［10］、杂交鳢（Channa maculata × C.argus）［11］、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）［12］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［13］、斑 点 叉 尾 鮰（Ietalurus punetaus）［14］以 及 对虾［15-16］等水产动物中开展了硝基呋喃类代谢物的药代动力学研究。对于中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis，以下简称河蟹），仅开展了呋喃西林代谢物的消除规律研究［17-18］，而对呋喃唑酮代谢物消除规律的研究尚未见诸报道。本研究以河蟹扣蟹为给药对象，研究了模拟实际养殖条件下的呋喃唑酮代谢物消除规律，评估了河蟹苗种期间使用呋喃唑酮药物的残留风险，以期为上市河蟹食品安全保障提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

AOZ和AOZ-D4，含量≥99%，购于德国Dr公司。呋喃唑酮原药（含量≥98%）购于衢州伟荣药业有限公司。乙酸乙酯、甲醇、正己烷等为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

Thermo TSQ Quantum Ultra高效液相色谱串联质谱仪（美国Thermo公司）；PHS-25酸度计（上海伟业仪器厂）；Mili-Q 纯水仪（法国Millipore）；Biofuge Primo R离心机（美国Thermo公司）；FA1004电子天平（上海精天电子仪器厂）；BSA2202SCW 电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；SHA-CA恒温水浴摇床（金坛市迅生仪器厂）；N-EVAP-111氮吹仪（美国Organomation）。

1.1.3 实验动物及场地

实验用蟹规格为（13±2）g的健康扣蟹（约7 500只，雌雄性别比约为1∶1）购自上海市崇明兴陆养殖合作社。实验开始前，随机抽取18只河蟹分为3组，取其肌肉、肝胰腺、鳃组织进行AOZ测定，结果均为未检出AOZ。药饵制备：将呋喃唑酮原粉与粘合剂（玉米淀粉）混匀后，加入温水调和，再按照每3 000 mg· kg-1和9 000 mg·kg-1比例加入饲料混匀，摄食率按1%计算。

养殖实验在面积为300 hm2、水深为1.2 m的室外养殖池塘进行，实验前对水体和底泥中呋喃唑酮及AOZ残留进行检测，结果均未检出。养殖期间水温保持在20.0～27.5℃。

锅炉汽包水位自动调节的任务是使给水量与锅炉的蒸发量相平衡，并维持汽包中的水位在工艺允许的范围内。水位过高，会影响汽包内汽水分离效果，使汽包出口的饱和蒸汽带水增多，造成不良后果；水位过低则造成水的急速蒸发，汽水自然循环破坏，锅炉壁容易被烧坏，严重时会造成爆炸事故。

1.2 实验方法

1.2.1 给药方法

将实验扣蟹暂养7 d后，将7 500只扣蟹随机平均放入P1组、P2组和对照组P0。将P1组、P2组和P0组分别饲养于4 m ×2 m ×1 m的自制铁网笼中，放入池塘。其中P1组和P2组每次投喂剂量分别为30 mg·kg-1和90 mg·kg-1的药饵，对照组投喂河蟹饲料，3组的投喂量保持一致。每天投喂2次（早上8∶00和下午3∶00各1次），连续投喂5 d。最后1次投喂后1 h，将河蟹表面清洗干净，转入池塘。按照河蟹常规养殖方法进行养殖［19］。

1.2.2 取样方法

实验样品分别按照最后1次给药后的1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、96 h、192 h、288 h、384 h、480 h、720 h、960 h、1 200 h、1 440 h、1 920 h、2 400 h、2 880 h和3 600 h进行取样。根据河蟹的生长状况，实验的前1 440 h，每6只河蟹为1个样品，实验1 440 h后，每3只河蟹为1个样品，每个样品分别取其肌肉、肝胰腺和鳃3个组织，样品置于-18℃冰箱中待测。

1.2.3 AOZ前处理方法

准确称取2.00 g（精确到0.01 g）样品置于30 mL离心管中，依次加入50μL内标工作液（100.0 ng· mL-1）、5 mL 盐 酸 溶 液（0.5 moL·L-1）和150μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.05 moL·L-1），涡旋1 min后，置于恒温水浴摇床37℃避光振荡16 h。取出离心管冷却至室温，加入5 mL磷酸氢二钾溶液（0.76 moL·L-1），调节pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，涡旋1 min，离心5 min，取有机相至离心管中，40℃氮气吹干。加入1.0 mL 5%甲醇水溶液溶解残留物，过0.22μm水相膜，供上机分析。

色谱柱为CAPCELL PAK C18（100mm×2.0 mm i.d.，5μm），柱温为30℃，进样量为10μL。流动相为0.1%甲酸（含2 mmol·L-1乙酸铵）（A）和甲醇（B）。流动相梯度洗脱程序如表1。

1.2.5 AOZ质谱条件

测定时设置为ESI+离子模式，离子传输管和气化室温度均为300℃，鞘气（N2）和辅助气（N2）压力分别为35 psi和8 psi，碰撞气（Ar2）压力为1.5 mTorr，采用选择多反应监测扫描模式；碎片离子及碰撞能量见表2。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Program of mobile phase gradient elution

表2 选择反应监测的定性离子、定量离子与碰撞能量Tab.2 Qualitative ions，quantitative ions and collision energy condition for selected reaction monitoring

1.2.6 标准工作曲线绘制与测定

配置1、2、5、20、40、100 ng·mL-1AOZ系列标准溶液，按1.2.3的分析条件进行处理。以AOZ与内标衍生物的峰面积比为纵坐标，AOZ浓度为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数。

1.2.7 数据处理

参考徐维海等［9］的方法，计算呋喃唑酮代谢物平均消除速率（v），单位为μg·（kg·h）-1，计算公式如下：

式中：Cmax为消除过程中测得AOZ的最高浓度（μg·kg-1），Cmin为消除过程中测得的最低浓度（μg·kg-1），t1为测到Cmax所对应时间（h），t2为测到Cmin所对应时间（h）。

2 结果与分析

2.1 方法检出限和定量限

实验结果（图1）表明，AOZ在1.0～100 ng·mL-1范围内线性关系良好，回归方程为：Y=0.024 092 1+0.092 585 6X，相关系数R2≥0.999 3。经加标实验确定方法检出限0.25 μg·kg-1（S/N≥3），定量限为0.5μg·kg-1（S/N≥10），回收率在80% ～110%之间，满足检测AOZ的定性和定量分析。

2.2 河蟹肌肉中AOZ的消除规律

从扣蟹到成蟹养殖过程中河蟹肌肉中AOZ含量的消除规律如图2所示。 肌肉中AOZ含量呈波动下降趋势，前期（1～288 h）下降速度较快，后期下降速度明显降低。两组不同浓度处理河蟹的AOZ在肌肉中的变化趋势基本一致。最高峰值均出现在最后1次给药后的1 h，其值分别为（172.0±7.2）、（952.0±75.2）μg·kg-1；第2个高峰均出现在48 h，其值分别为（77.0±7.9）、（217.0±14.9）μg·kg-1。第3个高峰仅在P2组出现（192 h），含量为（217.0±14.9）μg·kg-1。P1组河蟹肌肉中的AOZ在720 h时已经降低到（1.2±0.2）μg·kg-1。P1组河蟹肌肉中的AOZ含量低于判定限（1.0μg·kg-1）的时间为停止给药后的960 h。根据公式计算得到P1组河蟹肌肉中AOZ的平均消除速率为0.238 μg·（kg·h）-1。P2组河蟹肌肉中的AOZ含量在1 200 h时下降为（1.3±0.2）μg·kg-1，肌肉中AOZ含量低于判定限所需时间为停止给药后的1 440 h。根据公式计算得到P2组河蟹肌肉中AOZ的平均消除速率为0.767μg·（kg·h）-1。P2组的最高浓度是P1组的5.5倍，代谢时间比P1组长480 h，平均消除速率为P1组的3.2倍。

2.3 河蟹肝胰腺中AOZ的消除规律

整个消除阶段，河蟹肝胰腺中AOZ含量消除规律如图3所示。将图3与图2对比发现，河蟹肝胰腺与肌肉中AOZ的变化趋势基本一致。两试验组河蟹肝胰腺中AOZ的最高峰值均出现在最后1次给药后的1 h，其值分别为（347.0±25.2）（P1）、（2 475.2±128.3）（P2）μg·kg-1。第二个高峰均出现在48 h，其值分别为（217.0±14.9）（P1）、（752.0±34.5）（P2）μg·kg-1。第三个高峰均出现192 h，其值分别为（156.0±16.4）（P1）、（491.0±25.8）（P2）μg·kg-1。P1组河蟹肝胰腺中的AOZ降低到判定限（1.0 μg·kg-1）附近，所需时间为960 h，P2组为1 440 h。P1组河蟹肝胰腺中的AOZ低于判定限所需时间为1 200 h，P2组为1 920 h。根据公式计算，P1组肌肉中AOZ的平均消除速率为0.361 μg·（kg·h）-1，P2组为1.72μg·（kg·h）-1。

2.4 河蟹鳃中AOZ的消除规律

整个消除阶段，与肌肉和肝胰腺变化趋势一致，鳃中AOZ呈现波动下降趋势（图4）。鳃中AOZ在停药后1 h达到最高值，其值分别为（196.0±17.7）（P1）、（786.0±40.9）（P2）μg·kg-1，低于同期肝胰腺组织中AOZ的含量。与肌肉和肝胰腺相比，鳃中AOZ的下降速率最慢。P1组鳃中的AOZ降低到判定限（1.0 μg·kg-1）附近，所需时间为960 h，P2组为1 440 h，其值分别为（1.2±0.1）、（2.2±0.1）μg·kg-1。P1组鳃中的AOZ低于判定限所需时间为1 440 h，P2组为1 920 h。根据公式计算，P1组肌肉中AOZ的平均消除速率为0.136 μg·（kg·h）-1，P2组为0.409μg·（kg·h）-1。

3 讨论

3.1 河蟹不同组织中AOZ的消除规律

在停药后的1 h，各组织中AOZ的含量均达到最高值，肝胰腺中AOZ的含量高于肌肉和鳃组织，其主要原因为肝胰腺是体内药物代谢的主要器官，药物进入机体后，部分药物直接进入肝胰腺，还有部分药物可通过血液循环进入肝胰腺，从而导致肝胰腺中AOZ含量高于其他组织［20］。各组织中AOZ也以肝胰腺消除速率最快，以P1组为例，肝胰腺中AOZ消除速率为肌肉的1.5倍，为鳃的2.7倍。此外，河蟹各组织消除过程中均出现多峰现象，这在水产品中药物代谢中较为常见［14-15，21］，其主要原因可能与肠-肝循环、胃肠循环的非齐性有关［21］，但对于产生的机理仍有待进一步研究。在本实验中，P2组河蟹各组织AOZ的消除速率均高于P1组，其原因可能是AOZ在河蟹体内的消除为一级动力消除，药物在体内浓度越高，消除速率越快，当药物浓度降低后，消除速率逐渐下降。

3.2 不同物种中AOZ的消除规律

在本实验中，各组织中AOZ含量降低至判定限（1.0μg·kg-1）的最短时间为960 h，最长时间为1 920 h。谭志军等［13］研究报道，以15 mg·kg-1（体质量）剂量，每天投喂2次，连续投喂5 d，在185 d时，大菱鲆肌肉中AOZ的含量为（29.68±4.11）μg·kg-1。刘永涛等［22］研究报道，以100 mg·kg-1（体质量）剂量，每天投喂2次，连续投喂5 d，在停止给药90 d后，斑点叉尾鮰肌肉中AOZ降低至检测不出水平。AOZ在体内残留时间较长，主要原因可能与AOZ能够与体内蛋白质以共价键形式紧密结合有关［23］。AOZ在不同物种中残留时间存在较大差异，这可能与给药剂量、实验温度、富集浓度、养殖环境等因素有关［18］，也可能是不同物种之间的差异造成的。

4 小结

本实验以河蟹扣蟹为研究对象，模拟实际用药和养殖条件，系统研究了AOZ在河蟹体内的消除规律。实验结果表明，整个消除阶段，AOZ在河蟹体内消除呈现前快后慢的规律。AOZ在河蟹各组织中残留时间长，最长可达1 920 h。因此，在养殖过程中，应遵守相关规定禁止使用呋喃唑酮，同时还要加强管理，避免（苗种、饲料、渔药等）投入品带入呋喃唑酮，造成不必要的损失。