鲨鱼硫酸软骨素及胶原蛋白复方改善小鼠骨关节炎作用研究

颜晨燕，王梨萍，屈 鑫，李 锋，3，石贤爱，3

（1.福州大学生物科学与工程学院，福州 350106；2.福州大学药物生物技术与工程研究所，福州 350106；3.福建省医疗器械与生物医药省重点实验室，福州 350106）

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一类结构复杂的糖胺聚糖，其结构基本单元为D-葡萄糖醛酸与N-乙酰-D-氨基半乳糖通过1，3-糖苷键连接形成的二糖，二糖单元之间通过β-1，4-糖苷键连接而成。CS在动物体内广泛存在，多位于动物软骨中，是结缔组织的重要组成部分。近年来研究表明，CS具有多方面的生物活性。CS可降低血脂含量，抑制血栓的生成，具有调血脂和预防动脉粥样硬化的作用［1］；在抗关节炎方面，CS也具有显著的作用，CS可抑制机体关节损伤因子如基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、IL-1β的产生，从而延缓软骨损伤的进展，起着缓解关节炎的作用［2］；CS还能促进成骨细胞生长，诱导新骨生长，加速骨损伤的愈合过程［3］。此外，CS还具有抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤以及抗黏连等作用，因而在临床上被广泛应用［4］。胶原蛋白为细胞外基质结构蛋白，在动物体内广泛存在，主要存在于动物的皮肤和骨组织中。胶原蛋白最显著的结构特点是三螺旋结构，由3条α多肽链缠绕形成超螺旋结构。胶原蛋白的结构稳定，具有低免疫原性和良好的生物相容性，因而用途广泛［5］。近年来研究表明，胶原蛋白还具有调血脂、抗肿瘤、抗关节炎、免疫调节等方面的生物活性［6］，因而也被大量应用在膳食补充及医疗方面。

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性关节退行性疾病，其临床特征主要为关节软骨损伤、关节边缘骨赘形成和滑膜炎症等［7］。OA的发生发展与衰老、运动损伤等因素密切相关［8-9］。软骨损伤是OA最主要的病因，关节的整体稳态同时依赖于相关组织的相互作用，包括骨和滑膜组织。在OA的发生发展中，软骨下骨将出现病变硬化，且随着病情的发展其病变程度将越来越明显［10］。到目前为止，在临床上尚无有效的无创性治疗方法能逆转退行性关节炎的发生发展［11］。

鲨鱼（Carcharhiniformes）属于脊椎动物门，软骨纲，板鳃亚纲，在世界各大洋都有广泛分布，是我国重要的海洋鱼类资源［12］。鲨鱼头骨及椎骨均为软骨，含有丰富的硫酸黏蛋白、骨胶原蛋白成分［13］，鲨鱼鳍骨中也含有丰富的粘多糖和胶原蛋白［14］。作为鱼翅及相关产品的加工下脚料，鲨鱼软骨并未得到充分的利用，大多被直接丢弃，造成极大资源浪费，并带来了环境污染问题。尽管有部分研究者研究了硫酸软骨素对骨关节炎的改善作用［15-16］，但通过口服补充胶原蛋白，是否对骨关节炎有改善作用尚未可知，胶原蛋白和硫酸软骨素复方用于改善骨关节炎方面的研究尚未见报道。基于此，在本实验室前期研究的基础上，本研究将源自鲨鱼软骨的高纯度硫酸软骨素及胶原蛋白进行复方配伍，以考察其对注射胶原蛋白酶所致的小鼠膝关节炎的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

鲨鱼硫酸软骨素，由本实验从鲨鱼软骨中分离制备，纯度≥95%；鲨鱼胶原蛋白，由本实验从鲨鱼软骨中制备，纯度≥90%；以上两者按照质量比2∶1混合制得鲨鱼硫酸软骨素和胶原蛋白复方（shark chondroitin sulfate and collagen complex，SCC）；Ⅱ型胶原蛋白酶（酶活性为125 U·mg-1），购自美国Sigma公司；IL-1β、IL-4酶联免疫吸附检测试剂盒，RayBiotech公司；番红-O染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；天狼猩红染色试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司；Masson染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；H&E染色试剂，福州迈新生物技术开发有限公司。

1.1.2 实验动物

健康10周龄雄性昆明小鼠，购自上海斯莱克实验动物公司（SCXK沪2012-0002），在标准条件下分组饲养，共分4组，每组8只小鼠，具体分组为阴性对照组、OA模型组、SCC高剂量组、SCC低剂量组。实验过程中小鼠自由饮食及摄食。本研究遵循《实验动物保护条例》相关规定。

1.1.3 主要仪器

RM2245组织切片机，德国徕卡公司；KD-P组织摊片机，浙江科迪公司；SH-1000荧光全自动酶标仪，日本Corona公司。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型

为了诱导OA，参考已报道的造模方法［16］，稍作改动，简述如下。取1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，剃去右膝膝关节部位毛并消毒后，通过髌下韧带在右膝关节间隙注射5U （体积4 μL）Ⅱ型胶原蛋白酶（溶于无菌生理盐水中，酶活性为125 U·mg-1）。阴性组注射4μL无菌生理盐水作为对照。注射时将针的注射深度限制在1.5 mm，以免损伤关节软骨。

在实验的第0、2、4、6天各注射一次Ⅱ型胶原蛋白酶，每日观察关节肿胀情况，持续观察4周，记录并拍照。

1.2.2 给药

各组别均每日灌胃。SCC高剂量组按照300 mg·kg-1每日固定灌胃给药，SCC低剂量组为150 mg·kg-1；阴性对照与OA模型组每日取等体积生理盐水灌胃。药物干预4周后处死动物取血清，解剖后取小鼠关节，剔除肌肉后，用游标卡尺测量左右关节横向直径并计算关节肿胀度（%），计算公式为：肿胀度（%）=（右膝关节直径-左膝关节直径）/左膝关节直径 ×100。之后，将膝关节脱钙处理，进行病理切片染色分析。

1.2.3 关节病理切片及染色分析

取关节在室温下用5%硝酸脱钙10 h，后浸泡于4%多聚甲醛中24～48 h，梯度乙醇脱水（50%、70%、80%、90%和100%乙醇各1 h）、透明后常规组织包埋，组织切片做H&E染色以观察软骨形态。切片脱蜡水化后分别采用番红-O染色试剂盒、Masson染色试剂盒以及天狼猩红染色试剂盒按照说明书操作进行染色。番红-O染色结果软骨呈红色，骨呈蓝色或绿色；Masson染色结果胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核呈黑蓝色；天狼猩红染色结果胶原纤维呈红色，肌肉、神经胶质、胞浆、红细胞呈黄色。

1.2.4 酶联免疫吸附

小鼠眼球取血后斜放于冰上3 h，3 500 r·min-1离心20 min，分离血清。取IL-1β和IL-4酶联免疫吸附试剂盒按照说明书操作，检测在血清中的表达水平，每个组别检测3次，根据标准曲线计算出各组别的平均表达量。

1.3 数据处理

所有实验均重复至少3次，实验结果采用单因素方差统计法（T检验，P＜0.05）进行分析比较，用Origin 9.1软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

如图1和图2所示，造模4周后观察小鼠关节肿胀情况，可见模型组小鼠注射Ⅱ型胶原蛋白后右侧关节较左侧关节明显肿胀（图1-B）。实验第3周，可观察到给药组动物的关节肿胀程度逐渐减轻。最终实验结果显示，SCC低剂量（150 mg·kg-1）干预具有一定程度的抑制膝关节肿胀作用（图1-C）。相比低剂量，SCC高剂量（300 mg·kg-1）干预抑制关节肿胀作用更为明显（图1-D）；各组小鼠膝关节肿胀度情况比较如图2所示，药物干预组动物的膝关节肿胀程度明显低于模型对照组。

2.2 H＆E染色分析

如图3所示，模型组软骨细胞具有一定程度增殖，部分部位出现纤维肉芽组织填充（黑色箭头），软骨细胞分布不均匀，成混乱排列（图3-B）；与模型组相比，SCC低剂量（150 mg·kg-1）干预可改善软骨细胞分布，纤维肉芽组织消失（图3-C）。SCC高剂量（300 mg·kg-1）干预后关节软骨表面光滑，软骨四层结构比较清晰，排列规律，软骨细胞呈类圆形，细胞核紫蓝色，细胞质粉红色，细胞排列整齐，分布及染色均匀（图3-D）。

2.3 Masson染色分析

由于软骨和骨的细胞外基质中普遍分布着胶原纤维，因此Masson染色基质部分呈大面积蓝色，胶原纤维分为多种类型，软骨中主要为Ⅱ型胶原，骨组织中则主要为Ⅰ型胶原。图4显示了胶原（黑色箭头）在关节中的分布情况，与阴性对照组相比，模型组的软骨层中胶原纤维含量显著降低（图4-B），表明膝关节软骨受到明显损伤。与模型组相比，SCC低剂量干预（150 mg·kg-1）可使软骨层的胶原含量明显增加（图4-C），SCC高剂量（300 mg·kg-1）干预也可显著增加胶原含量，但相比低剂量增加并不明显。以上结果表明，SCC给药后可明显改善OA中胶原纤维流失状况。

2.4 天狼猩红染色分析

天狼猩红染色是利用两种阴离子染料混合成的试剂进行染色的一种方式，对胶原的显示也较为明显，在该染色法中胶原组织显红色。如图5染色结果所示，与阴性对照组相比，模型组的胶原组织（黑色箭头）含量明显减少（图5-B），表明软骨组织出现明显损伤。与模型组相比，SCC低剂量（150 mg·kg-1）干预可明显增加胶原含量（图5-C），SCC高剂量（300 mg·kg-1）干预可更大程度提升胶原含量（图5-D）。以上结果进一步证实了针对OA给予SCC干预可有效补充关节中胶原蛋白含量，从而减轻症状。

2.5 番红-O染色分析

软骨组织由软骨细胞和软骨基质组成，软骨组织及其周围的软骨膜构成软骨。软骨根据基质内所含纤维素成分不同分为透明软骨、弹性软骨、纤维软骨。番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映基质中蛋白多糖的含量和分布。当软骨受到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。由图6可知，与阴性对照组相比，模型组软骨组织着色明显较浅，且着色分布不均匀，表明软骨中糖蛋白（黑色箭头）流失明显，软骨组织受到明显损伤（图6-B）。与模型组相比，SCC低剂量（150 mg·kg-1）处理可显著增加着色程度，但着色分布还不太均匀（图6-C），表明SCC低剂量处理对软骨损伤有一定程度的修复作用。相比低剂量处理，SCC高剂量（300 mg·kg-1）处理既能增加软骨组织的着色程度，也能提升着色的均匀度（图6-D），表明在该剂量下，SCC处理具有较好地修复OA软骨组织的作用。

2.6 血清IL-1β和IL-4表达水平分析

通过ELISA法分析各组动物血清中IL-1β和IL-4的表达量，结果如图7所示。模型组造模后小鼠血清IL-1β的表达水平显著高于阴性对照组（P＜0.05，图7-A），而与此相反的是，模型组动物血清IL-4的表达水平显著低于阴性对照组（P＜0.05，图7-B）。与模型组相比，低剂量给药组（150 mg·kg-1）的两种细胞因子的血清表达水平均有一定的改善，但不具有显著性。高剂量组（300 mg·kg-1）动物的血清IL-1β水平显著低于模型组（P＜0.05，图7-A），血清IL-4的水平显著高于模型组（P＜0.05，图7-B）。以上结果表明，SCC给药干预可显著改善OA的炎症状态。

3 讨论

在本研究中，笔者采取向关节腔内注射Ⅱ型胶原酶的方法来造模，用以加速降解关节软骨组织中的胶原蛋白，从而造成关节软骨和滑膜病理损伤，以构建OA模型，相应损伤程度与酶的用量相关。采用Ⅱ型胶原蛋白酶直接注射入关节腔进行造模所需时间较短，酶的用量易控制，OA的病理损伤程度也易于控制，较其他造模方法而言更加简便［16］。本实验采用了Masson染色法和天狼猩红染色法来分析关节软骨组织中胶原的分布情况（图3，图4），结果显示，OA小鼠关节的胶原分布明显低于阴性对照组小鼠，表明出现了明显的关节软骨损伤，而采用SCC干预可有效改善OA小鼠的关节胶原缺失状态，从而缓解OA的症状。

作为关节软骨基质的重要组成部分，糖蛋白通过周围连接蛋白被束缚于软骨基质中。在正常生理状态下，关节软骨中糖蛋白的产生与降解达成一种动态的平衡，这对维持关节组织的新陈代谢和完整性是至关重要的。而在OA关节中，该平衡遭到破坏，糖蛋白的降解速度高于其合成速度，使得软骨组织产生明显的缺损。目前，软骨基质糖蛋白流失已被看作是OA发生的病理标志［17］。在本研究中，笔者采用番红-O染色的方法来分析关节软骨组织的糖蛋白分布状况（图6），结果显示，OA小鼠关节软骨的糖蛋白含量显著减少，病理缺损明显，而采用SCC干预可显著提高糖蛋白含量，有效缓解关节软骨组织的病理损伤。

在OA的发生发展中，血清中滑膜细胞可产生IL-1β致炎因子，通过IL-1β与肿瘤坏死因子等相互作用，最终将活化NF-κB信号通路，激活炎症表达通路［18］。同时，IL-1β将刺激软骨细胞和滑膜细胞产生基质金属蛋白酶，促进软骨基质的降解；刺激软骨细胞和滑膜产生一氧化氮，抑制软骨细胞增殖，诱导软骨细胞凋亡［19-21］。而对正常软骨细胞体外实验证实，IL-4通过抑制IL-1β诱导软骨细胞合成基质金属蛋白酶而起到软骨保护作用；同时IL-4也参与软骨细胞应力信号传导，是该通路中活跃的信号因子，调节软骨细胞功能和结构的完整性［22-25］。本研究显示，SCC给药干预可显著降低OA小鼠的血清IL-1β水平和提升血清IL-4水平（图7），表明SCC干预可有效降低OA小鼠的炎症状态，也提示SCC对OA的改善作用可能是通过作用于IL-1β或IL-4信号通路而实现。

4 小结

本文研究了鲨鱼源硫酸软骨素及胶原蛋白复方（SCC）对小鼠OA的改善作用。采用向膝关节内腔定量注射Ⅱ型胶原蛋白酶的方式构建OA动物模型，每天口服灌胃给予SCC干预4周。研究表明，SCC可恢复关节软骨中流失的胶原蛋白，降低IL-1β和上调IL-4的表达水平，从而显著改善Ⅱ型胶原蛋白酶所致的小鼠膝关节炎症状。研究显示，这种源自鲨鱼软骨的复方具有开发成膳食补充剂的良好前景，为鲨鱼软骨资源的深入开发提供了基础。