中华鳖Wnt4基因克隆及表达分析

张英萍，凌 晨，王利华，沙 航，邹桂伟，胥 焘，罗相忠，梁宏伟

（1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；3.上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；4.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443002）

Wingless 基 因 最 初 由 SHARMA 和CHOPRA［1］在果蝇（Drosophila melanogaster）中发现，其基因突变能导致果蝇翅膀的缺失，随后一种原癌基因int1［2］从小鼠（Mus musculus）乳腺瘤病毒诱导的小鼠乳腺癌中被克隆，由于2个基因具有较高的同源性且功能相似，故将它们合称为Wingless-type MMTV integration site family（Wnt）基因。Wnt基因家族是一类重要的分泌性糖蛋白信号分子，可以激活多种信号通路，在动物的早期发育及各种生命活动中发挥着重要作用［3～4］。从线虫到哺乳动物均发现Wnt基因家族的存在［5］，其具有高度的保守性［6］。

Wnt4基因是Wnt基因家族重要的成员之一，与脊椎动物两性生殖系统的发育有关［7］，介导Mullerian导管的初始形成，并调节类固醇生成的中肾细胞向发育中的性腺迁移［8～9］。在哺乳动物中，Wnt4基因已经被证实是卵巢分化的关键因子［10］。在小鼠中，Wnt4基因通过调节Follistatin基因的表达来参与卵巢发育［11］，雌性小鼠Wnt4的表达缺失导致XX性腺的雄性化［8］，而雄性中Wnt4的过表达则破坏睾丸血管和睾丸甾酮的合成［9］。在人体中，Wnt4与Dax1协同调控女性卵巢发育并阻止睾丸的形成［12］。Wnt4在哺乳动物调控性腺发育、调节缪勒氏管的形成、调控卵巢类固醇的生成及抑制睾丸的形成中起关键作用［13］。此外，Wnt4在哺乳动物中还参与了肾脏、肾上腺、乳腺和生殖系统的形成［7］。在鱼类中，Wnt4与性腺发育密切相关。 在半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）中，Wnt4参与了性腺发育的整个过程，且在精巢表达水平高于卵巢［14］。在黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）中，Wnt4被证实与卵巢发育和性别分化有关［15］。

中华鳖（Pelodiscus sinensis）属爬行纲，龟鳖目，鳖科，鳖属，俗称甲鱼、水鱼、团鱼［16］。在中国除西藏、青海和新疆外，各省市（自治区）均有分布，是我国重要的特种水产养殖对象之一，具有较高经济价值和药用价值［17］。在养殖过程中，雄性个体具有明显的个体大、生长速度快、裙边宽厚、营养价值丰富以及市场单价高等优势，因此性别控制和全雄苗种培育一直以来都是中华鳖研究的重要方向。本研究通过克隆中华鳖Wnt4基因，分析其在雌雄个体不同组织中的表达特征、胚胎不同发育时期的表达特征以及Wnt激动剂对Wnt4基因表达的影响，进而探讨Wnt4基因在中华鳖性别分化过程中的作用，以期为进一步开展中华鳖性别决定和性腺分化研究提供理论基础，并为全雄苗种培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用中华鳖成鳖于2018年3月采自安徽省喜佳农业发展有限公司。中华鳖雌雄个体各3只，其中雄性平均体质量为（395.36±20.55）g，雌性平均体质量为（283.72±18.02）g，经麻醉后解剖收集脑、性腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肠和肌肉等组织样品，置于 -80℃冰箱保存，用于总RNA的提取。中华鳖鳖卵于2018年5—6月收集自安徽省喜佳农业发展有限公司产卵场，置于温度为（30.0±0.5）℃恒温恒湿培养箱（湿度在80% ～85%）中进行孵化。

1.2 实验试剂

Wnt激动剂（Wnt agonist 1是具有细胞透性的Wnt信号通路激活剂，诱导依赖于β-catenin和TCF-4的转录活性，Selleck公司），总RNA提取试剂Trizol Reagent（Invitrogen公司），PCR Mix和GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit（北京擎科生物有限公司），SMARTer®RACE cDNA 5′/3′Kit（Takara），DNA凝胶纯化试剂（南京诺维赞生物有限公司），PMD-18T载体（Takara）和DH5α感受态细胞（武汉清阳渡生物有限公司），无特殊说明的试剂均为国产分析纯。

1.3 总RNA提取和cDNA第一条链合成

按照Trizol法提取总RNA，用超微量分光光度计 NP80 （德 国，IMPLEN）测 定 RNA 的OD260nm/OD280nm检测RNA的质量、纯度以及浓度，并用1% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit（北京擎科生物有限公司）和SMARTer®RACE cDNA 5′/3′Kit（大连，Takara）按照操作指南分别合成cDNA和RACE cDNA第一条链。

1.4 中华鳖Wnt4基因克隆

从NCBI数据库中获得海龟（Chelonia mydas）、三趾箱龟（Terrapene carolina triunguis）和美洲短吻鳄（Alligator mississippiensis）等物种Wnt4基因的cDNA序列，在保守区域设计简并引物Wnt4-CF和Wnt4-CR（表1），以中华鳖卵巢组织cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为50 L，反应程序为：98℃预变性2 min；98℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，35个 循环；72℃延伸2 min，4℃10 min。利用DNA凝胶纯化试剂盒（大连，Takara）回收目的片段产物。回收产物连接到PMD-18T载体（大连，Takara）上并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃培养过夜，挑取经菌落PCR检测阳性克隆菌液测序。

基于获得的中华鳖Wnt4基因片段的cDNA序列设计3′RACE引物Wnt4-3′-GSP和Wnt4-3′-NGSP，5′RACE 引物Wnt4-5′-GSP（表1）。以RACE cDNA第一条链为模板，GSP（Wnt4-3′-GSP和Wnt4-5′-GSP）和UPM（RACE试剂盒引物）为引物进行降落式PCR，反应程序如下：94℃5 min；94℃30 s，72℃3 min，5个 循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5 cycle；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环。再以3′端降落式PCR产物50倍稀释液为模板，Wnt4-3′-NGSP和UPM short（RACE试剂盒引物）为引物进行半巢式PCR反应，程序为：94℃5 min；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环。PCR产物经纯化、连接和转化，挑取阳性克隆菌液测序。

1.5 序列分析以及同源性分析

用DNAMAN软件包对获得的5′cDNA和3′cDNA及中间序列进行全长拼接，在NCBI数据库中利用在线ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找开放阅读框（ORF）；利用ExPASy ProtParam工具预测Wnt4蛋白质的基本理化性质；利用SOPMA工具预测Wnt4蛋白二级结构；氨基酸的多重比对采用Clustal X和DNAMAN 完成；糖基化位点采用在线软件NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测，用Mega7.0中的邻接法（NJ）构建系统进化树，并采用1 000次自举检验分析（bootstrap analysis）评估进化树分支节点的置信度。

1.6 组织表达特征分析

基于获得的中华鳖Wnt4基因cDNA全长序列用Primer 5.0设计实时荧光定量引物Wnt4-F和Wnt4-R（表1）。中华鳖18sRNA用作内参基因［18］，按照以下程序进行PCR扩增：95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，40个 循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。数据采用相对表达量的计算方法，即基因相对表达量=2-△△Ct法，2-△△Ct值代表目的基因与对照组表达量之间的倍数差异［19］。数据采用平均值±标准误差（mean±SD）表示，用SPSS22.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），使用Turkey多重比较法进行差异显著性分析，P＜0.05为显著性差异。

1.7 胚胎不同发育时期表达特征

按照TOKITA和KURATANI［20］胚胎分期标准采集30℃孵化条件下中华鳖胚胎发育的第14～21期胚胎样品，置于液氮中速冻，然后转移到 -80℃冰箱中保存。采用本实验室开发的性别标记进行胚胎性别鉴定［21］后进行荧光定量表达分析。

1.8 Wnt激动剂对Wnt4基因表达量的影响

依据已有研究报道得知：孵化温度为30℃时，孵化至第9天生殖嵴隆起，孵化至第15天原始性腺形成，孵化至第26天完成性腺分化［22］。因此我们在孵化至第15天原始性腺形成时，使用Wnt激动剂对胚胎动物极注射处理，用微量进样器分别注射1.0 g·L-1、2.5 g·L-1和5.0 g·L-1的Wnt激动剂各1 L，对照组dd H2O 1 L，用石蜡封口，继续孵化。收集注射后0、6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h胚胎样品，用于定量表达。

2 结果与分析

2.1 中华鳖Wnt4基因全长cDNA序列特征和系统进化

中华鳖Wnt4 cDNA序列全长为2 432 bp，开放阅读框（ORF）为1 095 bp，编码364个氨基酸，5′-UTR 48 bp和3′-UTR 1 289 bp（图1）。Wnt4蛋白含有2个N-糖基化位点分别位于N-109和N-310处，具有Wnt基因家族特有保守片段“CKCHGVSGSC”、24个Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列。用在线工具ExPASy对中华鳖Wnt4蛋白的二级结构进行预测，二级结构中无规则蜷曲（c）占46.98%、α-螺旋（h）占38.74%、延伸链（e）占9.89%、β转角（t）占4.4%。

不同物种Wnt4氨基酸序列分析结果见表2，中华鳖与海龟、三趾箱龟、美洲短吻鳄、达马拉鼹鼠（Fukomys damarensis）、裸鼢鼠（Heterocephalus glaber）、人（Homo sapiens）、小鼠、斑马鱼（Danio rerio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、半滑舌鳎、栉孔扇贝（Azumapecten farreri）和厚壳贻贝（Mytilus coruscus）同源性如表2所示，与海龟和三趾箱龟的同源性最高。

表1 中华鳖Wnt4基因扩增引物信息Tab.1 Information of primers for Wnt4 amplification in Pelodiscus sinensis

中华鳖Wnt4蛋白与海龟、三趾箱龟、美洲短吻鳄、裸鼢鼠、人、小鼠、斑马鱼、牙鲆、半滑舌鳎、栉孔扇贝和厚壳贻贝等11个物种的蛋白序列多重比较分析见图2，其序列比较保守，与其他物种有100多个Wnt保守位点。

基于邻接法（NJ）构建Wnt4蛋白氨基酸序列系统进化树（图3），结果为三大支，哺乳动物和爬行动物聚为一大支，其中哺乳类和爬行动物分别聚为一支：中华鳖与海龟、三趾箱龟和美洲短吻鳄等爬行动物聚为一支。硬骨鱼类聚为一大支，贝类聚为一大支。

表2 不同物种与中华鳖Wnt4蛋白氨基酸序列同源性比对Tab.2 Comparative identity of amino acid sequence of Wnt4

2.2 Wnt4基因在中华鳖组织中的表达特征

Wnt4基因在中华鳖雌雄个体不同组织中的表达结果表明，Wnt4基因普遍存在于中华鳖的脑、性腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肠以及肌肉等组织中，且广泛表达，但是表达存在一定的组织和性别特异性（图4）。性腺中表达量最高，肺次之；并且雌性卵巢表达显著高于雄性精巢（P＜0.05），具有显著的性别二态性。脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠和肌肉中，Wnt4表达量显著低于性腺和肺（P＜0.05）。肝脏中雄性的表达显著高于雌性（P＜0.05），而在脑、肺、肾脏和肌肉中，雌性表达显著高于雄性（P＜0.05）。

2.3 Wnt4基因在中华鳖胚胎不同发育时期的表达特征

为研究Wnt4基因在中华鳖性腺分化中的作用，采用qRT-PCR方法分析中华鳖Wnt4基因在雌雄中华鳖胚胎不同发育时期中的表达情况，结果如图5所示，Wnt4基因在性腺分化前的第14期已经有表达，性腺开始分化后在雌性胚胎中表达持续高于雄性（P＜0.05），在第20期和21期雌性胚胎中的表达极显著高于雄性胚胎（P＜0.01），表达呈现性别二态性。

2.4 Wnt激动剂对中华鳖Wnt4基因表达的影响

为研究Wnt激动剂对中华鳖性别发育的影响，采用qR T-PCR方法分析了注射Wnt激动剂后中华鳖胚胎发育过程中Wnt4基因的表达水平。不同浓度Wnt激动剂处理后Wnt4基因的相对表达如图6所示。

在雌性胚胎中，注射1.0 g· L-1和2.5 g·L-1的Wnt激动剂后，6～12 h表达显著低于对照组（P＜0.05）（图6-A，C），72 h表达达到最大峰值，96 h表达显著降低（P＜0.05）。注射5 g·L-1的Wnt激动剂后，在6～24 h内Wnt4表达与对照组无显著性差异（P＞0.05）（图6-E），在36 h表达显著增加（P＜0.05），72 h表达达到最大峰值，96 h后表达逐渐降低，Wnt4表达量显著高于对照组（P＜0.05）。

在雄性胚胎中，注射1.0 g·L-1Wnt激动剂后，6 h后显著上调Wnt4的表达（P＜0.05）（图6-B），36 h表达达到最大峰值，48 h后表达逐渐降低，72 h后表达显著低于对照组（P＜0.05）。注射2.5 g·L-1Wnt激动剂后，6 h显著上调Wnt4的表达（P＜0.05）（图6-D），96 h表达达到最大峰值，120 h时表达开始显著降低（P＜0.05）。注射5 g·L-1Wnt激动剂后，6～96 h表达逐渐上升，Wnt4表达显著高于对照组（P＜0.05）（图6-F），96 h表达达到最大峰值，120 h时表达开始显著降低（P＜0.05），但显著高于对照组（P＜0.05）。

在雌性胚胎中，注射1.0 g·L-1Wnt激动剂，Wnt4基因在36～144 h表达上调；浓度2.5 g·L-1时，在24～168 h表达上调；浓度5.0 g·L-1时，在24～168 h表达上调。在雄性胚胎中注射1.0 g·L-1Wnt激动剂，Wnt4基因在6～36 h表达上调；浓度2.5 g·L-1时，在6～96 h表达上调；浓度5.0 g·L-1时，在6～168 h表达上调。在胚胎中，随着注射浓度的增加，Wnt激动剂的作用时间总体上更持久。

3 讨论

Wnt信号通路是在进化上高度保守的信号途径，在胚胎发育、细胞分化、增殖以及凋亡等生理过程中均发挥了重要的调控作用，已经成为细胞生物学和分子生物学研究的一大热点［23］。本研究得到的Wnt4基因cDNA序列全长为2 432 bp，编码364个氨基酸，具有24个Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列，2个N-糖基化位点且有100多个保守位点，符合Wnt结构特点［2］。中华鳖Wnt4与同为龟鳖目的海龟和三趾箱龟同源性最高，达91.74%，与其他物种的同源性也较高。

Wnt4基因在哺乳动物［24-25］、鱼类［26-27］、贝类［28-30］、虾蟹类［31］等生物中的不同组织中均存在表达，Wnt4基因表达具有广泛性且其功能具有多样性，其可能参与了多种组织细胞的生命过程。中华鳖Wnt4基因在脑、性腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肠和肌肉等组织均有表达。Wnt4基因在中华鳖中同样具有多种功能，推测其可能参与了多种组织细胞的生命过程。Wnt4基因与多种动物的性别决定和性别分化密切相关，Wnt4基因突变，会导致性腺发育异常甚至性反转［7-9，11］。Wnt4基因缺失的小鼠可导致雌性胚胎发生雄性化［8］。BARRIONUEVO 等［32］研 究 发 现，小 鼠Wnt4基因在性别决定之前的性腺中存在表达，性别分化后在卵巢中仍持续表达，精巢中的表达显著下调，Wnt4基因参与雌性性别分化过程。本研究中华鳖Wnt4基因在性别分化前的第14期就在雌性胚胎中高表达，且在之后的胚胎发育过程中一直维持雌性高表达，雌性胚胎中的表达显著高于雄性胚胎中的表达，Wnt4基因同样也参与了中华鳖雌性性腺分化的过程。Wnt4基因发生突变会引起性腺发育异常甚至性反转［7，9，11］。Wnt信号通路是哺乳动物性别决定的关键因子［7］，但其作用机制仍不清楚。本研究中Wnt激动剂能上调中华鳖Wnt4基因的表达，随着浓度的增加Wnt4基因上调表达水平变高，推测其对性别发育有一定的作用，而其作用机制和对性别发育的作用还有待进一步研究。

本研究获得中华鳖Wnt4基因的cDNA全长序列，并分析序列特征、表达特征以及Wnt激动剂对其表达的影响。中华鳖Wnt4基因表达具有广泛性和一定的组织特异性，可能参与多种组织生物学过程，尤其是在卵巢发育或其功能维持上起关键作用，参与了中华鳖雌性性腺分化过程，结果有助于中华鳖性别分化分子机制的进一步研究。