20-03软枣猕猴桃雄株组织培养技术研究

2021-01-10杨殿静曲淼刘政王丹萍张功何广仁

吉林蔬菜 2021年4期

杨殿静曲淼刘政王丹萍张功何广仁

软枣猕猴桃（Actinidia arguta（Sieb.et Zucc.）Planch.ex Miq.），属猕猴桃科（Actinidiaceae），猕猴桃属（Actinidia），落叶大藤本，具有很高的营养价值和药用价值。主要采用种子及扦插方式进行种苗繁殖。但种子繁殖周期长、苗木生长势参差不齐;枝条扦插受母株数量及质量限制，繁殖系数较低，减慢了优异资源的驯化及推广工作。植物组织培养具有生长周期短、繁殖系数高等优点，应用此技术可加快软枣猕猴桃优异资源的驯化及种苗繁殖速度。本文是以延边大学农学院朴一龙教授提供的20-03软枣猕猴桃雄性株进行组织培养获得的试验结果技术总结。

1 诱导培养

1.1 组织培养准备

1.1.1 诱导培养基准备：①MS+ZT2mg/l+NAA0.2mg/l+GA31.0mg/l;②MS+ZT1.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;③MS+ZT2mg/l+NAA0.2mg/l;④MS+ZT1.0mg/l+NAA0.1mg/l;⑤MS+6BA2mg/l+NAA0.2mg/l+GA31.0mg/l;⑥MS+6BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l。

每个配方加白糖30g/l、，琼脂4.1g/l，ph6.0培养基准备50瓶，240ml培养瓶装60ml培养基，0.103MPa，121℃，20min湿热灭菌。

1.1.2 工具准备：手术刀、剪子、镊子、接种盘包好，170℃，120min干热灭菌。

1.1.3 灭菌液准备：①75%酒精2000ml放入2000ml的容量瓶中。②01%HgCl2000ml放入2000ml容量瓶中，瓶中加入1滴吐温-20。③无菌水准备：每次10瓶1000ml三角瓶装入600ml自来水封口，0.103MPa，121℃，30min湿热灭菌。④500ml广口瓶做灭菌瓶，封口，170℃，120min干热灭菌。

1.1.4 接种准备：接种室放入接种工具，培养基，无菌水，O3消毒12h，石棚紫外线30min照射表面灭菌。

1.1.5 材料准备：延边大学农学院朴一龙教授提供的20-03软枣猕猴桃雄性株盆栽苗，选择生长健壮，无病虫害的当年生半木质化带腋芽枝条。

1.2 灭菌接种

1.2.1 灭菌：①半木质化带腋芽雄花软枣猕猴桃枝条用剪刀去除叶片，叶柄长度留1cm，茎段长度5～10cm，能放入灭菌瓶中即可，上芽和下芽茎段长度最低1cm。②将切好茎段放入5%洗涤液中用软毛刷清洗茎段表面，尤其叶腋处，反复清洗几次，再用自来水冲洗2～4h。③将清洗好的茎段在超净工作台上取出放入灭菌瓶中，在超净工作台上倒入75%酒精至瓶一半，摇晃30s，残液倒出;加入0.1%HgCl瓶2/3，摇晃2min，残液倒出;再用无菌水清洗6次，彻底l残液。灭菌完成。

1.2.2 接种：①接种材料处理：取出灭菌的半木质化带腋芽雄花软枣猕猴桃枝条，放入接种盘中，去除叶柄，在灭菌茎段两端0.5cm处切去，再将长茎段切分成1～1.5cm茎段，每茎段带1各腋芽。②切分成1～1.5cm茎段用镊子插入诱导培养基，每1瓶插入1个茎段，直插入或斜插入，芽朝上，芽露出在培养基面上。③接种完的培养瓶记录各类事项，放入培养室。

1.2.3 培养条件：培养室温度25℃，空气相对湿度50%，光照强度2000Lux，光照时间为昼12h，夜12h。

1.3 诱导培养

1.3.1 初代接种污染率、材料杀死率：接种污染率受采条部位、时间、地点、存放时间、清洗程度、灭菌时间、各项准备工作质量、人员操作水平多因素影响。灭菌时间长初代接种材料污染率低、材料被灭菌液杀死率高;嫩茎段相对初代接种材料污染率低、材料被灭菌液杀死率高。0.1%HgCl灭菌2min，初代接种污染率平均65%、材料杀死率平均16%。剪切材料处理时间长，初代接种污染率更高。

1.3.2 诱导培养基筛选结果与讨论：

①20—03雄株初代诱导30d统计结果

②20-03雄株初代诱导30d统计结果讨论：Ga3具有打破软枣猕猴桃夏芽休眠，促进芽萌发;Zt促进芽萌发效果好于6BA，更适于软枣猕猴桃組织培养;在可见芽情况下，嫩芽更易萌发。

2 继代增殖

2.1 继代时间：诱导培养60～70d，芽伸长5cm以上，形成长茎段后，可以切剪成0.5～1cm带芽茎段，转接至继代培养基上。

2.2 继代培养基：①Ms+Zt1.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;

②Ms+Zt2.0mg/l+NAA0.2mg/l+GA31.0mg/l;③Ms+Zt3.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;④Ms+Zt2.0mg/l+NAA0.4mg/l+GA31.0mg/l;⑤Ms+Zt2.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;⑥Ms+Zt1.0mg/l+NAA0.05mg/l+GA31.0mg/l。

2.3 20-03雄株继代培养60d统计结果

2.4 20-03雄株继代培养60d统计结果讨论：①Zt：NAA10：1，Zt1.0mg/l-2.0mg/l，NAA0.1mg/l-0.2mg/l比例，浓度适于软枣猕猴桃继代培养，芽绿色、茎间适中、茎粗度适中，适合转接继代操作。①②培养基为适宜继代培养。②继代时间以55～65d为宜，苗高5～7cm，茎段硬度宜于剪切。培养基营养、水分已不适合继续培养。

2..5 激素替代试验：因为Zt价格高，是6BA、Kt的百倍、几十倍，为节约生产成本，用6BA、Kt替代Zt，试验结果显示，6BA在继代5代以后可以替代Zt，但增殖系数有所下降;Kt在培养软枣猕猴桃中没有增殖作用。

2.6 继代接种密度：软枣猕猴桃继代接种密度与培养基营养消耗、个体光照强度、呼吸消耗等密切相关，关系继代苗异养能力和生长势，密度大，苗弱小，密度小，增殖率低，综合各方因素和观察，瓶直径6.5cm，240ml培养瓶继代每瓶接种7～8株，同时方便操作。

2.7继代培养条件：基本与诱导培养条件相同，但有时为了延缓继代转接时间压力，可以降低培养温度至20～22℃，延缓软枣猕猴桃生长速度，保证继代转接时，苗处于最佳时期。

3 生根培养

3.1 生根培养基筛选：①1/2Ms+NAA0.5mg/l;②1/2Ms+NAA0.3mg/l;③1/2Ms+NAA0.1mg/l;④1/4MS+NAA0.5mg/l;⑤1/4MS+NAA0.3mg/l;⑥1/4MS+NAA0.1mg/l。

每个配方加白糖15g/l，琼脂4.1g/l，ph6.0培养基准备50瓶，240ml培养瓶装60ml培养基，0.103MPa，121℃，20min湿热灭菌。

3.2 20-03雄株生根培养统计结果

3.3 20-03雄株生根培养统计结果讨论：①茎基是否有愈伤与苗移栽成活率密切相关，愈伤组织越大，苗移栽成活率越低。茎基直接生根，苗移栽成活率显著提高。②培养基营养水平太低，不利于生根。③适宜生根培养基为生根培养基。④生根40d后即可移栽。

3.4 温室移栽炼苗成活率与生根培养关系

3.4.1 试管苗生根阶段的炼苗

直径6.5cm、容量240ml培养瓶中苗数量与苗成活率

讨论：综合育苗成本、操作效率、成活率等因素，生根阶段每瓶苗数量适宜5株。