肠道菌群和胆结石的研究进展

张乾，左磊，张小冬，温波，任建军

(内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050)

0 引言

胆结石病是全球范围的常见病、多发病。在欧洲和其他发达国家[1]，胆结石的发病率可高达20%，这也是医疗成本增加的主要因素。而在我国胆结石的发病率约为4.2% ～12.1%[2]。近几年来随着经济社会的发展、人们生活方式的改变以及人口老龄化的发展，胆结石的患病率处于逐渐上升的趋势。胆结石疾病是由遗传、环境、局部、全身和代谢异常等复杂因素相互作用引起的[3]。由于胆结石形成因素多，所以其病理生理较为复杂，主要有以下几点[4]：致石基因及遗传因素的不同；胆汁胆固醇分泌不平衡；胆固醇成核异常/结晶；胆囊运动受损；胆囊腔内高分泌和粘蛋白凝胶积聚；免疫介导的胆囊炎症；肠道因素包括胆固醇吸收、肠道运动迟缓和肠道微生物群改变。随着肠道测序技术的发展以及对肠道菌群功能的不断发现，越来越多的研究表明肠道菌群的动态平衡对人体的健康有着非常重要的意义。近年来相关研究表明，胆石症患者肠道微生物群的失调可能与胆结石的形成密切相关[4]，但肠道菌群影响胆结石形成的机制仍不清楚。因此，本文就肠道菌群与胆结石的相关性及肠道菌群影响胆结石形成的可能机制进行阐述，为肠道菌群在未来胆结石的研究上提供一定的参考依据。

1 肠道菌群的组成及功能

肠道菌群被称为“我们遗忘的器官”，其拥有多达1000个细菌物种，编码约500万个基因，执行宿主生理和生存所需的17种功能[5]。大多数成人微生物群生活在肠道中，仅在人类的结肠中微生物的密度就超过了1011 cell/g，约1-2kg[6]。肠道菌群包括需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌，以专性厌氧菌或兼性厌氧菌为主。其中拟杆菌门和厚壁菌门的数量占90%以上[7]，其余有变形菌门、疣微菌门、放线菌门、梭杆菌门、双歧杆菌、蓝藻细菌等[8]。人体健康与肠道菌群的组成和功能有着千丝万缕的联系，肠道菌群像是我们的一个器官，提供了干预性治疗的新路径。肠道菌群参与物质和能量的代谢，促进免疫系统的发育成熟，形成黏膜屏障，并保护宿主免受病原体攻击[9-13]。一般情况下，肠道菌群按一定比例组合，各菌群间互相制约、互相依存，在质和量上形成一种动态平衡。但在某些情况下这种平衡被打破，即肠道菌群失调，可导致人类疾病的发生。肠道菌群的失衡与克罗恩病、肠炎、肥胖、糖尿病以及心血管疾病等代谢性疾病有关[14-18]。因此，肠道菌群对人体的健康有着非常重要的意义。

2 肠道菌群与胆结石的相关性

基于解剖学的角度来说，认为胆囊通过胆囊管—胆总管—十二指肠，与胃肠道是一个整体，同属于消化道，肠道细菌可逆行进入胆道，影响胆道细菌，进而影响胆结石的形成。早在20世纪60年代就有学者提出细菌在胆结石发病机制中的重要作用[19]。随着肠道菌群测序技术的进步，越来越多的研究表明肠道菌群和胆结石存在着明显的相关性。吴韬等人[20]利用新兴的高通量的二代测序的方法(焦磷酸测序)，通过大规模的分析细菌的16S rRNA基因，第一次揭示了胆囊结石患者存在明显的肠道菌群失调，研究结果发现正常人和胆囊结石患者肠道菌群存在差异，胆结石患者的肠道细菌中变形菌门(Proteobacteria)较正常人显著增高；三个肠道细菌粪杆菌属(Faecalibacterium)，毛螺菌属(Lachnospira)，罗氏菌属(Roseburia)较正常人显著减少。Wang等人[21]通过对C57BL/6小鼠饲喂成石饲料的研究表明，胆固醇成石小鼠肠道菌群丰富度和多样性均降低，主要表现为厚壁菌(Firmicutes)的低表达，同时厚壁菌门(Firmicutes)/拟杆菌门(Bacteroidetes)的比例降低。另有研究发现与健康人群相比胆囊结石患者粪便中瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和颤螺旋菌属(Oscillospira)种类增加，但细菌多样性显著降低[22]。马俊[23]研究表明，无症状胆囊结石患者较健康人将比，乳酸菌、普拉梭菌、毛螺科菌、罗氏菌属明显降低，变形菌门的含量显著升高。邓太平等人[24]研究表明，胆结石组的肠杆菌、肠球菌、链球菌的菌落数明显高于健康组，双歧杆菌和乳酸杆菌的菌落数与健康组相比显著下降。杜国涛等人[25]近期研究发现，胆结石患者与将康人相比。双歧杆菌和乳酸杆菌的含量显著减少，而大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌和酵母菌则相反。这些均提示肠道菌群的失衡可能对胆结石的形成具有重要的意义，但是肠道菌群影响胆囊结石形成的机制目前尚不明确。

3 肠道菌群参与胆结石形成的可能机制

3.1 肠道菌群可能通过影响胆汁酸代谢进而影响胆结石的形成

胆汁酸是胆固醇的主要代谢终产物，具有表面活性作用，在脂质的吸收和利用过程中起重要作用。胆汁酸是由胆固醇通过至少14种肝脏酶的协同作用合成的[28]。胆汁酸有两条合成途径[27]：经典途径和替代途径。经典途径是初级胆汁酸合成的主要途径，占人类初级胆汁酸合成总量的90%，因该途径的中间产物为中性类固醇，故也称中性途径。胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)是经典途径中的限速酶，甾醇12α羟化酶(cholesterol 12α-hydroxylase，CYP8B1)、甾 醇27α羟 化 酶(cholesterol 27α-hydroxylase，CYP27A1)也参与催化这一途径，经过一系列酶促反应将胆固醇转换为鹅去氧胆酸(CDCA)和胆酸(CA)。替代途径是合成初级胆汁酸的另一途径，因该途径产生酸性类固醇故也称酸性途径，该途径由CYP27A1和氧固醇7α羟化酶(oxysterol 7α-hydroxylase，CYP7B1)催化，主要产生鹅去氧胆酸，占人类初级胆汁酸合成总量约10%。在肝细胞内初级胆汁酸分别与甘氨酸和牛磺酸结合形成具有生理作用的结合胆汁酸，后通过肝细胞胆小管侧膜上的胆盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)泵入胆小管，进入胆囊，然后进入小肠。结合胆汁酸则在回肠顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(apical sodium dependent bile acid transporter，ASBT)重吸收后，与回肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid-binding protein，IBABP)结合，经基底侧膜有机溶质转运体 (organic solute transporter，OST)α/β重吸收进入门静脉血流。门静脉中的胆汁酸最后被肝细胞通过钠离子依赖性牛磺胆酸钠协同转运蛋白(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)介导结合胆汁酸转运、有机阴离子转运多肽1(organicanion transporting polypeptide1，OATP1)介导游离胆汁酸转运，两者共同介导循环胆汁酸重新被摄入肝细胞，上述过程称为胆汁酸的肠肝循环。胆汁酸总量的95%经肠肝循环重新回到胆汁酸池，仅有5%左右经肠道排出体外。胆汁酸动态平衡受到胆汁酸对CYP7A1活性和表达的负反馈作用以及通过法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)和成纤维细胞生长因子19(fibroblast growth factor 19，FGF19)的信号传导的调控。

肠道菌群在胆汁酸的修饰和转化过程中发挥着重要的作用。结合胆汁酸在肠道中通过胆盐水解酶(bile salt hydrolase，BSH)生成游离胆汁酸。目前研究表明，肠道中存在着广泛的可以产生BSH的细菌[28]。肠道中的游离胆汁酸在7α脱羟基菌的作用下生成具有疏水性的次级胆酸石胆酸(DCA)和脱氧胆酸(LCA)。现研究表明，具有7α脱羟基活性的菌主要有仅Clostridium属以及Lachnospiraceae和Peptostreptococcaceae[29]。Sayin等[30]研究表明，与无菌小鼠相比，正常小鼠的胆汁酸池发生了明显的变化，小鼠回肠上皮细胞表面的FXR表达水平上调，FXR进一步诱导成纤维细胞生长因子15(fibroblast growth factor 15，FGF15，人体中为FGF19)的表达，进而抑制CYP7A1、CYP27A1的活性，从而抑制胆汁酸的合成。与此同时Sayin 等人还发现牛磺-β鼠胆酸(taurobeta-muricholic Acid，T-βMCA)是FXR的天然受体拮抗剂，能够减轻对CYP7A1的抑制作用，从而促进胆汁酸的合成。Out等人[31]试验表明，肠道细菌能够通过刺激肠道上皮细胞中转录因子GATA4的表达，抑制 ABST的表达，从而导致回肠末端胆汁酸的重吸收减少。相反胆汁酸也会影响肠道菌群的组成，小鼠口服1.25～5.00 mmol/kg 体重的胆汁酸，其肠道菌群中厚壁菌属的比例由54%升高至94%～98%，而其中拟杆菌和放线菌的比例则显著降低[32,33]。Ava等人[34]研究发现，胆汁酸受体FXR 基因缺陷型小鼠的肠道厚壁菌属数量显著上升，而拟杆菌属数量显著下降，这是由于FXR 受体缺陷时胆汁酸的分泌增加导致的，这提示胆汁酸可通过FXR 信号通路影响肠道菌群组成。Degirolamo 等[35]用乳酸菌、双歧杆菌和嗜热链球菌组成的混合益生菌饲喂小鼠，结果发现，该混合益生菌能够显著增加肠道中厚壁菌属和放线菌属的数量，降低拟杆菌属和变形杆菌属的数量，增加粪便中胆汁酸的排出量，降低肠道FGF15的表达水平，提高CYP7A1 和 CYP8B1的活性，从而增加肝脏胆汁酸的产量。早在1996年Berr等人[36]就研究表明，7a-脱羟基肠道细菌可增强胆结石患者DCA的输入量和胆汁胆固醇饱和度。有趣的是近期Wang 等人[37]研究表明，胆结石患者与健康人群相比，初级胆汁酸和次级胆汁酸显著增高，且7a-脱羟基肠道细菌显著增加。这些研究强有力的证明肠道菌群和胆汁酸代谢存在着明显的相关性，且胆汁酸的的代谢在胆结石的发生发展中发挥着重要的作用，因此肠道菌群可能通过调节胆汁酸代谢进而影响胆结石的形成。

3.2 肠道菌群可能通过影响肠道屏障进而影响胆结石的形成

肠道既是人和动物对营养物质消化、吸收和代谢的主要场所，也是保障机体内环境稳态的先天性屏障，被誉为“机体的第二大脑”。肠道屏障是一种半透性结构，允许吸收必须的营养素和免疫感应，同时限制致病分子和细菌，维护机体肠道健康。在正常情况下，肠道粘膜屏障由机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障组成。肠道微生物的构成的微生物屏障是肠道屏障的重要组成部分，通过微生物竞争黏附等机制抑制有害病原菌在体内定值与增殖，保护机体免受外界病原体和毒素的入侵[38]。研究表明，肠道菌群失调可能破坏肠粘膜屏障，并可能增加对某些疾病的易感性[39]。肠粘膜屏障的破坏会使脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)更容易的通过肠道屏障进入肝脏。正常的情况下少量LPS通过肠道屏障进入肝脏，通过激活肝脏的免疫系统将其清除。然而，在肠道粘膜屏障功能破坏的情况下，肠肝循环平衡受损，肠道易位细菌及肠源性LPS增加，后者可通过模式识别受体如Toll样受体4(tolllike receptor-4，TLR4)激活肝脏免疫细胞，最终诱导炎症和促炎细胞因子的产生，从而帮助清除入侵的病原体[40,41]。王学军[42]等人通过对胆结石组和对照组的胆汁酸分析，发现胆结石组中LPS的含量显著高于对照组。与此相契合的是，白顺滟等人[43]发现胆色素结石患者肠道粘膜通透性较健健康组相比存在明显的降低。因此我们猜测肠道菌群失衡会导致肠道粘膜的通透性，影响LPS的易位，并激活肝脏的免疫，其分泌的炎性细胞因子通过旁分泌方式，改变了肝细胞的正常代谢，并有可能通过信号传递系统，改变细胞内某些酶的活性和表达，从而在胆石的形成中发挥重要的作用。

3.3 肠道菌群可能通过影响免疫进而影响胆结石的形成

肠道菌群在宿主免疫系统的发育和成熟中起着至关重要的作用。这一点在无菌小鼠身上得到了最清晰的证明，这些小鼠从出生起就被培养成完全没有任何微生物的动物。与常规饲养的小鼠相比，这些动物表现出严重不发达的肠道免疫系统[44]。肠道菌群可调控宿主免疫，包括调节性T细胞(Treg)、TH17、TH1等免疫细胞[45]。肠道菌群除自身参与调节免疫外其代谢产物短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)也参与免疫的调节。SCFA是碳链1-6的有机羧酸，是肠道菌群发酵碳水化合物的主要终产物，其主要包括乙酸、丙酸和丁酸[46]。肠道菌群产生的SCFA在保护肠道粘膜屏障[47]和免疫中发挥重要的作用。研究表明，SCFA通过减少巨噬细胞、中性粒细胞及树突细胞的募集和迁移，并抑制T细胞和B细胞的分化，以调节免疫应答和炎症[48]。有趣的是越来越多的研究表明，胆结石和免疫存在着明显的相关性。免疫系统在胆固醇结石发病机制中的作用的证据来自Maurer等人[49]的研究，其发现丧失T或B细胞功能的Rag缺陷小鼠与野生型小鼠相比其成石率显著降低，将脾细胞或T淋巴细胞向Rag缺陷小鼠移植，发现其结石形成率明显增高，而B细胞的移植却没有结石形成率的明显变化，该研究证明T细胞免疫在促进胆固醇胆结石形成方面发挥了深远的作用；此外，还证明了T细胞和固体胆固醇晶体在胆囊中诱导了强力的Th1介导的局部炎症反应。李平等人[50]研究发现，急性和未发作的胆结石患者均存在T淋巴细胞亚群比例失调，急性发作时，CD3+、CD8+T细胞升高，使免疫应答增强。有趣的是，近期Muñoz等人[51]研究表明，胆结石中含有中性粒细胞的胞外DNA及其产生的弹性蛋白酶，中性粒细胞外杀菌网络(neutrophil extracellular traps，NETs)对胆结石的形成是必须的，人源和鼠源的胆结石中均存在NETs，并且胆结石的形成和生长需要先天免疫系统的活化。这些研究表明肠道菌群可能通过调节免疫进而影响胆结石的形成。

4 结语

综上所述，肠道菌群的改变与胆结石的形成密切相关，肠道菌群可能通过影响胆汁酸代谢、肠粘膜屏障和调节免疫等机制，参与胆结石的发生和发展，但这些可能的机制需要我们进一步研究阐明。由于胆结石作为一类代谢性疾病，因此，肠道菌群最可能通过改变人体代谢或其自身产生的代谢产物进而影响胆结石的形成，这需要我们对胆结石患者的代谢产物进行检测并与肠道菌群进行关联。希望从肠道菌群靶向治疗的角度为胆结石提供新的防治策略。