最低抑菌浓度法在耐药结核分枝杆菌药敏试验中的应用

吴敏，周洪经，李志媛，张秀雯，孙海柏，张丽霞，陈怀永

1天津市海河医院，天津300350；2国家中医药管理局中医药防治传染病重点研究室

结核病是全球范围内致死的十大原因之一，每年有数百万人患上结核病。据世界卫生组织估算，2017年全球结核病潜伏感染人群约为17亿，中国估算结核病新发患者数为88.9万，估算结核病发病率为63/10万，在30个结核病高负担国家中估算结核病发病率排第28位。估计2017年全球有55.8万人为耐利福平结核病（RR-TB），而这些人中有82%为多重耐药结核病（MDR-TB）［1-4］。抗结核一线药物链霉素（SM）、异烟肼（INH）、利福平（RIF）、乙胺丁醇（EMB）有强杀菌作用，价格低廉，不良反应少，可口服，是治疗肺结核的基本用药之一；相对于一线药物来说，抗结核二线药物卷曲霉素（CPM）、卡那霉素（KAN）、氧氟沙星（OFX）、对氨基水杨酸（PAS）临床疗效较差，毒性较大，主要用于对一线抗结核药物不耐受者，一旦出现不良反应应立即停止服药。因此，正确的抗结核药物的选择对结核病的治疗起关键作用。目前检测抗结核菌药物敏感性实验的金标准为改良罗氏比例法，它可以检测SM、INH、RIF、E 4种抗结核一线药物和CPM、KAN、OFX、PAS 4种二线药物，但检测药物种类固定，且周期长。最低抑菌浓度法（MIC法）是一种比较新的药敏检测方法，可以检测4种一线抗结核药物和10种二线抗结核药物［SM、INH、RFP、EMB、左氧氟沙星（Lfx）、阿米卡星（Am）、CPM、丙硫异烟胺（Pto）、力克肺疾（PI）、莫西沙星（Mfx）、Pas、利福布汀（Rfb）、卡那霉素（KAN）、氯法齐明（Cfz）］，其操作简便，报告时间快，且准确率高［5-7］。本研究采用MIC法药敏试验检测129例分枝杆菌培养阳性菌株，并以改良罗氏比例法药敏试验为金标准作对照，分析MIC法检测抗结核药物的准确性和符合率。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂及仪器 选取天津市海河医院2019年6—8月结核科住院患者和门诊患者培养分枝杆菌阳性菌株129份（参照结核分枝杆菌抗原检测方法，即取1 mg/mL菌液100µL滴到检测的样本滴下部，15 min后观察检测板的判定部；检测线及质控线双方都确认出现紫红色条带判定为阳性，提示样本中有结核菌的存在；检测线处没有出现紫红色条带，只在质控线出现紫红色条带判定为阴性）。MIC分枝杆菌药敏检测试剂盒（培养法）购自珠海市银科医学工程股份有限公司，罗氏培养基和含药罗氏培养基均购自杭州创新生物检控技术有限公司结核分枝杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法）购自杭州创新生物检控技术有限公司，标本前处理液2%N-乙酰-L半胱氨酸-NaoH消化液（2%NaoH-NALC）购自珠海贝索生物科技股份有限公司。电热恒温培养箱购自上海森信实验仪器有限公司，超声比浊仪购自广东体必康生物科技有限公司。

1.2 结核分枝杆菌的分离培养 患者标本采用NALC法消化液前处理，取1～3 mL标本于50 mL离心管中，加入2倍体积的前处理液消化震荡15 s液化，静置15 min，加入无菌生理盐水至45 mL，然后以4 000 r/min速度离心20 min，弃去上清，在沉淀中加入1 mL的无菌生理盐水，震荡重悬，取100µL接种改良罗氏培养基2支，放置37℃恒温培养箱培养。3 d观察有无污染，以后每周观察1次，2～3周后出现可见菌落可用于药敏检测［8］。

1.3 结核分枝杆菌的改良罗氏比例法药敏试验 取分枝杆菌阳性菌株，用一次性接种环取部分菌落至含2 mL生理盐水的超声比浊管中，调菌液浓度为1 mg/mL，分别取高稀释度（10-4）菌液一环，划线接种空白对照培养基和含药培养基（SM 4µg/mL、INH 0.2µg/mL、RFP 40µg/mL、EMB 2µg/mL、CPM 40µg/mL、PAS 1µg/mL、OFX 2µg/mL、KAN 30µg/mL）；然后分别取低稀释度（10-2）菌液一环，划线接种空白对照培养基和含药培养基，37℃恒温培养箱培养，4周后观察结果。质控菌株H37RV作为全敏感标准菌株，由天津市疾病控制中心提供。计算耐药百分比，耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基生长的菌落数×100%，若耐药百分比≥1%，则判断为耐药［8］。

1.4 结核分枝杆菌的MIC法药敏试验 分离获得处于对数生长期的结核分枝杆菌，磨菌比浊至1 mg/mL。取出冻干杂菌抑制剂，将无菌稀释液全部加入后充分摇匀。取出药敏培养基及药敏测试板，吸取100µL混合均匀的杂菌抑制剂加入药敏培养基，充分混匀。用无菌吸嘴先分别吸取180µL药敏培养基加入到A1或E1、B1或F1，分别作为1/10、1/100参照孔。用无菌吸嘴吸取200µL药敏培养基加 入 到C1、D1或G1、H1作 为 阴 性 参 照 孔。取100µL菌液（1 mg/mL）加入到整支药敏培养基中混匀。每孔加200µL含有菌液的药敏培养基（除上述4孔），再吸20µL至A1或E1孔作为1/10参照孔，从A1或E1孔吸20µL至B1或F1作为1/100参照孔，盖上盒盖，用透明胶带沿周边封一圈后，置37℃培养，7～10 d后观察结果。孔底出现白色菌体沉淀为阳性［9］，利用微生物常规药敏试验扫描系统可直接得到药敏结果。耐药判断标准（最佳临界值）：SM 4µg/mL，INH 0.2µg/mL，RFP 4µg/mL，EMB 2.5µg/mL，Lfx 2µg/mL，Am 1µg/mL，CPM 2.5µg/mL，Pto 10µg/mL，PI 0.5µg/mL，Mfx 0.5µg/mL，Pas 2µg/mL，Rfb 0.75µg/mL，KAN 2.5µg/mL，Cfz 2µg/mL。

1.5 微量MIC法在结核分枝杆菌药敏检测中准确性评估 以改良罗氏比例法药敏实验为金标准，通过计算敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值及其诊断符合率，以评价微量MIC法再分枝杆菌药敏检测中的准确性。

2 结果

改良罗氏比例法药敏试验结果：对于SM敏感菌有100株，耐药菌有29株；对于INH敏感菌有101株，耐药菌有28株；对于RFP敏感菌有109株，耐药菌有20株；对于EMB敏感菌有118株，耐药菌有11株；对于KAN敏感菌有124株，耐药菌有5株；对于氨基水杨酸敏感菌有125株，耐药菌有4株；对于OFX敏感菌有108株，耐药菌有21株；对于CPM敏感菌有125株，耐药菌有4株。

MIC法药敏试验结果对于SM敏感菌有103株，中敏菌有4株，耐药菌有22株；对于INH敏感菌有102株，中敏菌有0株，耐药菌有27株；对于RFP敏感菌有109株，中敏菌有1株，耐药菌有19株；对于EMB敏感菌有117株，中敏菌有9株，耐药菌有3株；对于左氧氟沙星敏感菌有112株，中敏菌有15株，耐药菌有2株；对于阿米卡星敏感菌有124株，中敏菌有0株，耐药菌有5株；对于CPM敏感菌有123株，中敏菌有6株，耐药菌有0株；对于Pto敏感菌有127株，中敏菌有2株，耐药菌有0株；对于PI敏感菌有116株，中敏菌有8株，耐药菌有5株；对于莫西沙星敏感菌有111株，中敏菌有11株，耐药菌有7株；对于对氨基水杨酸敏感菌有121株，中敏菌有4株，耐药菌有4株；对于Rfb敏感菌有114株，中敏菌有14株，耐药菌有1株；对于KAN敏感菌有116株，中敏菌有8株，耐药菌有5株；对于氯法齐明敏感菌有128株，中敏菌有0株，耐药菌有1株。

两种检测方法中，有7种药物为其共有，以改良罗氏比例法药敏试验检测为金标准，MIC法中敏菌和耐药菌合并为一组数据，通过计算灵敏度、特异度、阴性预测值、阳性预测值及其诊断符合率结果表明；对于SM药敏检测的灵敏度为100.0%，特异度为97.1%，阳性预测值为89.6%，阴性预测值为100.0%，诊断符合率为97.7%；对于INH药敏检测的灵敏度为96.3%，特异度为98.0%，阳性预测值为92.8%，阴性预测值为99.0%，诊断符合率为97.7%；对于RFP药敏检测的灵敏度为95.0%，特异度为99.1%，阳性预测值为95.0%，阴性预测值为99.1%，诊断符合率为98.4%；对于EMB药敏检测的灵敏度为83.3%，特异度为99.1%，阳性预测值为90.9%，阴性预测值为98.3%，诊断符合率为97.7%；对于KAN药敏检测的灵敏度为38.5%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为93.5%，诊断符合率为93.8%；对于氨基水杨酸药敏检测的灵敏度为50.0%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为96.8%，诊断符合率为96.9%；对于CPM药敏检测的灵敏度为66.6%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为98.4%，诊断符合率为98.4%。

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，当结核分枝杆菌侵袭数量达到一定程度，大于机体免疫力抵抗时容易引起疾病［10］，结核菌可能侵犯人体各种器官，但主要侵犯肺脏，引起肺结核病，呼吸道是其传播主要途径。传染源是接触排菌的肺结核患者，临床上多呈慢性过程，常伴有低热、乏力等全身中毒症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现，常用结核菌素皮肤试验（TST）进行筛查［11］。免疫力低下人群例如艾滋病、糖尿病患者更容易罹患该病［12-13］，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染引起肺外结核［14］。2021年是开启“十四五”规划的第一年，距离实现联合国“2030年可持续发展议程”结核病控制目标和“2035年终止结核病流行”目标，只剩下10年和15年的时间，也将是结核病防治迈上新台阶的一年［15］。结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，是专性需氧的一类细菌，抗酸染色阳性，无鞭毛，有菌毛，有微荚膜但不形成芽孢，其细菌壁既没有革兰阳性菌的磷壁酸，也没有革兰阴性菌的脂多糖，细长略带弯曲的杆菌，大小1～4×0.4µm。初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。作为胞内致病菌，结核分枝杆菌在宿主细胞内潜伏或增殖，其不仅能被宿主吞噬细胞所吞入，还可入侵以造血干细胞和间充质干细胞为代表的干细胞［16］。

在我国结核菌药敏检测曾用绝对浓度法，但该方法对混悬液制备、接种量的要求非常严格，对操作者的技术要求较高，且此法未对“耐药”“敏感”进行明确定义。因此，改进后罗氏比例法药敏检测被WHO推荐为金标准，可对药物灵敏度试验中的接种量进行校正，通过配置1麦氏单位标准浓度菌液，进行百倍稀释和万倍稀释后接种含药培养基，通过计数生长菌落数直观的判定敏感、耐药。同时检测四种抗结核一线药物SM、INH、RFP和EMB和四种二线药物CPM、KAN、OFX和PAS，4周后观察结果［17］。依据所得药敏结果，将结核病患者耐药分为以下四种。单耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对一种一线药物抗结核药物耐药。多耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对不同时包括INH、RFP在内的一种以上的一线抗结核药物耐药。耐多药（MDR-TB）：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实至少对INH、RFP耐药。严重耐多药（XDR-TB）：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实除了至少对两种主要一线抗结核药物INH、RFP耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗生素（如氧氟沙星）产生耐药，以及三种二线抗结核注射药物（如CPM、KAN、丁胺卡那霉素等）中的至少一种耐药。耐多药结核病患者一般至少需要24个月的治疗，重症患者可能需要36个月的治疗，但治愈率仅为50%～60%。这使得耐多药结核病的经济负担比非耐多药结核病病例高出10～100倍。而使用二线药物治疗耐多药结核病需要更长的时间，因为二线药物更昂贵，副作用更多。因此，控制结核病多药耐药病例的比例，是我国公共卫生工作的重中之重［18-19］。

表型检测方法为金标准，但检测周期较长且药物种类受限，目前只包括8种抗结核药物。我们选择MIC法的优点为检测所需时间较短，操作简便，所需仪器设备简单，可同时检测多种抗结核药物，满足临床需求，同时还可以得到菌株的MIC值，更有利于指导临床用药［5］。SCHÖN等［20］研究表明，适用于大多数细菌病原体的MIC检测标准也应适用于结核分枝杆菌复合体。MIC试验不同于常规药敏试验在单一临界浓度下的药敏试验，它能定量地反映耐药情况。研究［21］发现，氟喹诺酮类药物的MIC值增加与糖尿病、年龄＞40岁与治疗失败显著相关，与耐多药肺结核患者治疗失败相关。刘金娜［22］研究表明，微量液体培养基MIC法应用于结核分枝杆菌药敏试验中与罗氏比例法有着良好的一致性，且检测速度快，经济适用性好。马小华等［23］发现，采用基因芯片法进行NTM菌种鉴定，对不同类型菌种进行归类，并采用微量稀释法进行NTM药物敏感试验，依据CLSI标准判断结果，计算药物对细菌的MIC50和MIC90值，分析药敏结果可以为临床治疗提供理论依据。本研究利用结核分枝杆菌MIC法和罗氏比例法药敏检测试剂盒检测抗结核药物灵敏度，比例法结果表明各种药物耐药率分别为SM 22.5%、INH 21.7%、RFP 15.5%、EMB 8.5%、KAN 3.9%、PAS3.1%、OFX 16.3%、CPM3.1%；MIC法 检 测 结 果 为SM 20.2%、INH 20.9%、RFP 15.5%、EMB 9.3%、KAN 10.1%、PAS 6.2%、LFX 13.2%、MFX 14.0%、CPM 4.7%；两种方法检测结果较一致。其他抗结核药耐药率检测结果为Cfz 0.8%、Pto 1.6%、PI 10.1%、Rfb 11.6%、AM 3.9%。与比例法药敏结果相比，MIC检测SM、INH、RFP、EMB、KAN、PAS、CPM药物的符合率较高，分别为97.7%、97.7%、98.4%、97.7%、93.8%、96.9%、98.4%。在耐药性检测方面，以传统比例法为金标准，MIC法对于一线药物耐药检测的灵敏度和特异度都较高，对于二线药物检测灵敏度较低，这可能与药物作用机制不同有关，可以进一步做药物机制研究的临床验证。