供者特异性抗体对儿童肝移植预后的影响

肖艳丽，李西川，刘伟，刘纯，康中玉，孙超，3，马楠，3，李代红

1天津医科大学，天津300070；2天津市第一中心医院；3天津市器官移植重点实验室

肝脏是人体最大的免疫特惠器官，有观点认为较少发生排斥反应，原因可能是其具有丰富的血管床和双重供血系统，Kupffur细胞能够吸收游离状态的免疫球蛋白，可分泌可溶性的HLA分子中和已产生的游离抗体，肝脏损伤后具有强大的再生能力［1-2］。供者特异性抗体（DSA）是指受者接受器官移植或者组织移植后，体内产生的针对供者组织抗原的特异性抗体，其产生增加肾移植、心脏移植和肺移植患者排斥风险，或导致同种异体移植失败［3］。在实际的临床工作中，一直忽视肝移植受体DSA的监测，以及DSA在肝移植后的损害作用。但随着免疫学的不断发展，DSA在肝移植中的意义已经被人们重新认识起来。近期国外研究表明，DSA与肝脏的损伤有一定的关联［4］。而在肝移植方面，尤其是儿童肝移植术后DSA的产生对术后移植物存活的影响尚未见系统性报道。本研究回顾性分析了50例接受肝移植并在肝穿刺活检时检测HLA抗体儿童的临床资料，分析DSA的产生与肝脏生物化学指标和肝脏组织学以及移植术后并发症之间是否存在一定相关性，比较阴性组和阳性组的相关指标，研究供者特异性抗体在小儿肝脏移植中的临床影响以及如何提高受者长期存活率。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取择期行肝移植的患儿50例，男28例，女22例；中位年龄1.0岁；先天性胆管闭锁45例，进行性家族性肝内胆汁淤积症2例，鸟氨酸代谢紊乱2例，Alagille综合症1例。纳入标准：①在2013—2018年在我中心器官移植科接受亲体器官捐献或已故供体肝移植的儿童患者（18岁以下）；②临床资料完整，实验室相关化验完整；③进行肝穿刺活检同时检测HLA抗体；④均有供者的血清或者脾脏标本，进行HLA分型；⑤随访时间12个月以上。移植术前进行了HLA抗体检测19例。患者随访时间（33.2±2.97）个月。

1.2 移植手术、免疫抑制方案和术后管理 所有患儿均行肝移植，其中亲体部分肝移植29例，公民逝世后捐献器官肝移植21例。移植受者术中静脉注射甲泼尼龙10 mg/kg，巴利昔单抗10 mg（体质量＜30 kg），术后第4天给予巴利昔单抗10 mg，进行免疫诱导。肝移植术后第2天开始给予他克莫司，肝移植术后3个月内采用他克莫司联合甲泼尼龙的免疫抑制方案，维持他克莫司血药浓度谷值浓度在7～10 ng/mL，口服甲泼尼龙，剂量为4 mg/d，随后逐渐减量，至术后3个月时撤除；术后3个月后仅单用他克莫司，血他克莫司浓度谷值维持4～6 ng/mL。

1.3 DSA检测 儿童肝移植术后患者，在随访当天抽取肝移植受者的静脉血3 mL（无添加剂），血液在无菌条件下收集，新鲜时进行分离操作，以避免因为不适当的存储条件导致假阳性、假阴性反应或者样本污染。全血及时进行分离操作，1 000 g离心10 min，分离血清于冻存管，血清在2～8℃不能超过48 h，如果需要存储超过48 h，则应该在-20℃以下温度保存或-80℃存储两年以上。应用Luminex液相芯片技术，依据试剂盒的说明书进行抗HLA抗体SAB检测，LIFECODES LSA Single Antigen检测试剂盒选自美国IMMUCOR公司。将待测血清与包被了特异性抗原的微珠加入到Millipore微孔板中，经过30 min孵育，若血清中存在HLA抗体则可与微珠上的抗原结合，利用抽真空方法洗涤除去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗染色，孵育后，通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗体类型。微球被红绿染料设计成深浅不同的荧光编码，在被激光扫描时测量目的荧光的平均强度（MFI）。我们通过分析软件获得MFI的大小，并根据MFI划定阴阳性参考范围。结果判读标准：MFI＜750阴性；750～4 000弱阳性；4 000～10 000中阳性；＞10 000强阳性。如果多个位点阳性，以MFI值最高的为主，抗体特异性通过与供体配型比对，确定是否为DSA。

1.4 肝脏纤维化活检 受者进行HLA抗体检测同时进行肝穿刺活检，经全身麻醉和局部消毒后，在超声引导下进行肝活检，在受者腋中线或腋前线第7～9肋间隙的肝浊音区穿刺获取1条完整肝活检组织，要求1条组织长度＞1 cm最满意，每例样本观察6个组织切面，所有病例通过免疫荧光或免疫组织化学方法进行常规苏木素和伊红、Masson三色和补体4d（C4d）染色。依据Banff ACR RAI标准对移植肝T细胞介导的排斥反应（T-Cell Mediated Rejection，TC⁃MR）进行评分，将门管区“三联征”按其RAI各计3分，总分为9分。经Masson三色和网状纤维染色评价肝脏纤维化及坏死程度，依照指南［5］对结果进行判定和强度分级。纤维化分级为半定量分级，具体分级：无纤维化记0分，致密周围和脉络膜纤维化记1分，周围纤维化和非桥联门静脉纤维化记2分，桥联纤维化显示中心到中心桥联记3分，广泛的桥联和脉络膜纤维化显示肝硬化记4分。

1.5 肝功能指标检测 晨起空腹时采集受者静脉血标本3～5 mL，标本采集送检后1 000 g离心10 min，分离血清，采用罗氏Cobas c 311全自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）及总胆汁酸（TBA），通过HISS系统进行数据收集。

1.6 患儿产生DSA时的随访时间、存活、并发症记录 记录产生抗体时的随访时间、存活、并发症情况。

1.7 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以四分位数间距（非正态分布）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料采用χ2检验；Kaplan-Meier曲线用于事件发生时间的结果，并进行log-rank检验组间的生存率差异。肝纤维化评分使用单向有序定性资料的秩和检验（Kruskal-Wallis法）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

50例肝移植患儿，DSA阳性者24例（阳性组），全部以抗HLA-Ⅱ类抗体为主，且抗HLA-DQ抗体是主要的抗体；DSA阴性者26例（阴性组）。

阳性组移植肝纤维化12例（50.0%），其中肝纤维化评分0分6例、1分2例、2分3例、3分1例；阴性组移植肝纤维化4例（15.4%），其中肝纤维化评分0分、1分各2例；两组移植肝纤维化比较，P＞0.05。

阳性组、阴性组血清ALT水平分别为24.40（18.45～73.73）、19.00（17.90～65.00）U/L，血清AST水 平 分 别 为46.50（31.00～54.00）、33.80（27.33～51.78）U/L，血清ALP水平分别为201.50（178.25～338.50）、232.10（136.67～338.42）U/L，血清GGT水平分别为14.50（11.25～26.25）、11.20（7.23～23.11）U/L，血 清TBA水 平 分 别 为8.00（7.08～10.50）、9.11（5.00～25.03）µmol/L，两组血清AST水平比较，P＜0.05。

阳性组、阴性组产生抗体时的随访时间分别为43、17个月，两组比较，P＜0.05。阳性组、阴性组术后1年的存活率分比为91.7%（22/24）和96.2%（25/26），两组比较，P＞0.05。阳性组2例患者死亡，死亡原因为心功能衰竭和呼吸系统衰竭，分别随访43、27个月；阴性组1例患者死亡，随访13个月，受者抗HLA抗体显示阴性，但是肝功能指标显示异常增高，于是进行了二次肝移植术。阳性组并发症为抗体介导的排斥反应1例，胆道并发症2例，慢性排斥反应2例，TCMR 3例，药物性肝损伤4例；阴性组并发症为慢性排斥反应1例，TCMR 2例，药物性肝损伤4例，血管并发症5例，胆道并发症5例，感染5例。

3 讨论

肝移植已经成为治疗终末期肝病的一种有效的治疗方法，几十年来我国的成人肝移植手术技术已逐渐成熟，而对于儿童终末期肝病来说，可以通过活体肝移植或肝DCD移植手术获得较理想的效果。随着儿童肝移植手术的经验积累和技术的提高，受者术后成功率和生存率有明显的提高，但是术后并发症发生率仍然较高。尤其对于肝移植受者早期检测出DSA，避免排斥反应的发生，提高移植后的患者长期存活率，是肝移植长期存活的受体研究中需要关注的问题。

肾脏移植和心脏移植受者的DSA与急性T细胞介导的排斥、抗体介导的排斥进展为慢性排斥、晚期移植物功能障碍、血管病变和同种异体移植物丢失有关［6-7］。而在肝移植，越来越多的证据表明，DSA的存在与移植后的排斥、纤维化、炎症有关。另文献报道肝移植后DSA患者的比例在8%～67%［8-9］，这些DSA阳性患者中的大多数是针对II类HLA抗原的抗体［10］。WOZNIAK等［11］报道DSA的患病率约为56%。GRABHORN等［12］报道称，20例（47%）儿童患者在死亡或活体供体肝移植后有DSA，并且几乎所有的儿童患者都有DSA。研究［13］显示，在32例DSA阳性患者中，所有患者在各自的肝活检中都有某种形式的纤维化，而35例DSA阴性患者中有24例患者存在某种形式的纤维化，并且DSA阳性患者的纤维化倾向于严重的分级。在儿童肝移植患者中，DSA的危险因素包括移植年龄较小，移植后生存时间长，爆发性肝炎病史等［14-16］。KANEKU等［17］发现，移植术后新生DSA可显著降低肝移植受者和移植物的长期存活率。与DSA阴性受者相比，术后新生DSA阳性的受者1年内死亡风险增加了1.99倍（P=0.005），移植物功能衰竭风险增加了1.85倍（P=0.01）。王永翠等［18］发现，DSA组与非DSA组术后1年、2年存活率比较，差异无统计学意义。

本研究显示，儿童移植受者的DSA患病率为48.0%，DSA的类型主要是具有高MFI值的二类HLA抗体。本研究结果与外文文献阳性率大体一致。研究中DSA阳性患者中有一半患有纤维化，而DSA阴性患者中有15.4%（4/26）患有纤维化，且两者无统计学差异，本文的局限性在于纳入的研究对象样本量少，增加了Ⅱ型错误的风险。我们比较两组的肝功生物化学指标，发现阳性组的AST数值表现比阴性组更高，说明DSA对肝移植受者的肝脏功能有一定的影响。只有19例病例在移植前进行了PRA的检测，其他病例未在移植前进行抗体检测，因此对于DSA无法判断是术后新生还是术前预存，更无法比较新生DSA对于肝移植受者和移植物的存活率的影响。因此，根据我中心的临床经验，建议所有的肝移植等待者在评估时进行HLA抗体检测，对于有致敏史的患者，更应多次检测抗体水平。本研究缺少AMR的确诊病例，原因可能为临床上对于AMR的诊断具有一定难度，急性AMR的最终诊断需结合临床表现、DSA检测、组织病理学和C4d检测结果等予以综合判定，而AMR临床表现的时间可能早于或晚于移植物损伤出现严重程度的时间。

随着DSA继发同种异体移植损伤的证据越来越多，在肝脏移植受者的长期管理中进行DSA监测的问题已经被重新认识。监测实体器官移植后DSA水平的中心指南，数据来源大多是基于肾和心脏移植［19］。最近，移植工作组会议报告［20］建议对肝移植受者进行常规DSA监测。虽然可能没有必要对所有肝移植受者进行常规DSA监测和常规移植活检，但可能有高危肝移植受者群体将受益于移植前和术后定期DSA筛查。临床上应用血浆置换、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白、静脉注射免疫球蛋白和类固醇治疗循环DSA的受体。蛋白酶体抑制剂及其与下一代共刺激阻断联合使用已被证明在肾移植的临床前模型中是有效的［21-24］。然而，这些新的治疗方法在肝移植DSA介导的损伤中的适用性仍有待观察。

总之，肝移植后DSA对于受者的预后有一定的影响，未来还需要利用更大规模的肝移植受体进行DSA与病理学结果的分析，并思考如何共同利用DSA和其他指标，早期预防排斥反应，或制定合理的干预措施，增加受者生存时间。