蛋白聚糖调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

吴靖漪 陈嘉文 孙天语 刘鹏 吴补领

南方医科大学口腔医院1种植中心，4牙周科（广州510280）；2南方医科大学南方医院口腔科（广州510515）；3南方医科大学口腔医学院（广州510515）；5南方医科大学珠江医院口腔科（广州510282）；6南方医科大学深圳口腔医院（坪山）（广东深圳518118）

间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有多向分化潜力，由于其来源广泛并可以在体外大量扩增，是骨组织再生工程中热门的种子细胞，并在临床试验中获得了显著的修复效果［1-2］。先前研究主要集中在多种信号分子对干细胞稳态的调控［3］，然而干细胞微环境亦是干细胞成骨分化的关键影响因素。蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）是构成MSCs 微环境的最主要成分之一［4］，参与调控其自我更新与谱系分化之间的动态平衡。既往研究认为蛋白聚糖具有组织特异性，能够参与配体、趋化因子、生长因子等在细胞外的梯度扩散。近年来研究还表明蛋白聚糖能与细胞外信号分子结合共同调控信号通路的传导，从而影响干细胞自我更新和成骨分化之间的动态平衡［5-6］。深入揭示蛋白聚糖在干细胞成骨分化中的调控机制，能够为干细胞在骨修复应用中的临床转化提供理论依据。本文将重点阐述蛋白聚糖调控不同间充质干细胞成骨分化的作用、潜在机制及其临床应用。

1 蛋白聚糖的结构组成及功能特点

蛋白聚糖是由一个或多个GAGs 通过丝氨酸残基以共价键形式结合在一个核心蛋白上组合而成的多糖大分子，是细胞膜及细胞外基质的重要构成成分，与细胞的结构和功能紧密相关。

蛋白聚糖的生物学功能主要来源于其结构中多样的GAGs 链。GAGs 是由二糖单位重复连接形成的高硫化线性多糖，主要分为硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸软骨素（chondroitin sul⁃fate，CS）、硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）、硫酸角质素（keratan sulphate，KS）、透明质酸（hyaluron⁃ic acid，HA）和肝素（heparin，HEP）［6］。不同的GAGs 之间主链差异较小，但经进一步硫酸化、脱乙酰基和异构化修饰后，GAGs 长链间出现明显生物构象及功能差异。GAGs 属于翻译后修饰产物，其合成无确定的模板，组织器官来源及个体化差异等均会影响其硫酸化修饰，各异的硫酸化修饰的位点和硫化程度使GAGs 具有丰富的结构域，能够为不同的信号蛋白、生长因子及趋化因子等提供结合位点［7-8］，以此赋予蛋白聚糖不同的生物学功能。GAGs 的表达具有明显的时空特异性，它通过不断调整自身糖链结构，以在不同时期适应与特定生长因子的结合，协助其扩散或与其受体竞争性结合这些生长因子，从而双向调控信号通路传导。此外，GAGs 与特定生长因子具有高亲和力，可以结合并保护这些生长因子免受蛋白酶降解，进而维持稳定的信号分子浓度梯度。

由此可见，多样的GAGs 与其所依附的核心蛋白决定着蛋白聚糖将以多种方式广泛参与细胞的生物学活动［9］。蛋白聚糖持续参与重塑动态变化的细胞微环境，影响干细胞及子代细胞的增殖与分化［6］，广泛参与调控胚胎发育［10］、细胞分化［11］、组织再生［12］以及肿瘤进展［13］等多个生物学环节。

2 蛋白聚糖在干细胞成骨分化中的作用

蛋白聚糖与骨组织发育再生密切相关，大量研究已观察到核心蛋白聚糖（decorin）、双链蛋白聚糖（biglycan）、基底膜聚糖（perlecan）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）等多种蛋白聚糖在骨组织发育的不同时期广泛表达，这些蛋白聚糖参与构成骨基质的形成和矿化，在骨组织发育及修复中起着必不可少的作用。FAM20B 调控着蛋白聚糖上的GAGs 与核心蛋白之间链接区内木糖（xylose）的磷酸化，是GAGs 连接于蛋白聚糖发挥正常生物学功能的必要激酶。LIU 等［10］在神经嵴来源的间充质细胞内特异性敲除Fam20B 基因，导致GAGs 无法与核心蛋白顺利连接，构建了GAGs 缺失小鼠模型，观察到小鼠颅面部骨骼发育明显异常，表现为骨质矿化不足，颅缝较正常小鼠显著增宽。说明蛋白聚糖对骨骼系统的正常发育起着关键的调控作用。

蛋白聚糖在骨组织中的作用不仅在动物体内观察到，参与编码多种蛋白聚糖的基因突变亦会导致遗传性骨发育疾病。Schwartz⁃Jampel 综合征的致病基因是编码Perlecan 的基因突变，突变患者分泌到细胞外基质内的Perlecan 显著减少，阻碍生长板的正常形成，并引起软骨细胞聚集障碍，导致严重的软骨发育不全及骨组织的结构异常［14］。

骨骼系统的正常发育不仅依赖于蛋白聚糖的完整功能，蛋白聚糖正常的硫酸化修饰对于骨组织发育亦起着不可或缺的调控作用。SLC26A2 是胞膜上的硫酸盐转运体，可为蛋白聚糖的硫酸化修饰提供充足的硫酸盐，其功能缺失导致软骨细胞及成骨细胞的硫酸盐摄取显著下降，软骨内的蛋白聚糖硫化程度严重降低，生长板内的Ihh 信号通路的活性降低，抑制软骨细胞增殖，推迟次级骨化中心的形成，最终造成多种遗传性骨发育疾病的发生，包括骨畸形性发育不良、软骨成长不全以及多发性骨骺发育不良［15］。由此可见，蛋白聚糖广泛参与了骨和软骨发育形成的全过程，其完整的结构和功能时刻影响着复杂的骨组织发育调控网络，是骨骼系统发育生长调控的关键分子。

2.1 蛋白聚糖在调控骨髓间充质干细胞分化中的作用间充质干细胞自我更新和成骨分化之间的稳态是目前研究的重点之一，其精准调控需要多个信号分子有序的时空表达。目前的观点认为GAGs 是干细胞转向分化状态中必需的信号调控分子。敲除小鼠ESCs 中编码HS 链合成的Ext⁃1 基因后，干细胞的分化活动明显受阻［16］。蛋白聚糖作为该动态平衡中重要的信号分子，它的种类及分布具有明显的组织特异性。随着MSCs 进行成骨分化，蛋白聚糖的表达模式也不断地发生着变化，CSPG 和DSPG 的含量逐渐降低，相反的HSPG含量逐渐上升［17］。与蛋白聚糖中的核心蛋白相比，其上共价连接的GAGs 是影响MSCs 成骨分化的关键。在MSCs 成骨向分化时，合成HS、CS、DS所需的关键酶XT⁃Ⅰ、EXTL2、GalNAcT 及硫化酶HS6ST3 的表达显著上调［18-19］。由此可见，GAGs 及其硫酸化修饰紧密调控着MSCs 的成骨向分化。体外研究亦表明加入外源性GAGs 能有效增强MSCs的成骨分化潜力，成骨分化的相关基因例如骨钙素、骨粘连蛋白和Ⅰ型胶原等表达显著上调［20］，加速骨缺损的愈合［21］。

2.2 蛋白聚糖在调控牙源性间充质干细胞成骨分化中的作用除了调控间充质干细胞成骨分化，多种蛋白聚糖如基膜蛋白聚糖（lumican）、多能蛋白聚糖（versican）、骨调蛋白（osteomodulin，OMD）、Asporin 及外源性的HEP 在牙源性干细胞中的成骨作用也是近年研究的热点。研究者们在牙髓组织中观察到基膜蛋白聚糖、多能蛋白聚糖等多种蛋白聚糖的表达，可能密切调控牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的增殖和分化［11，22］。JIANG 等［23］通过在体外牙胚培养中添加化学分子Xyl⁃MU，抑制GAGs 与核心蛋白的连接，观察到成牙本质细胞的成骨向分化严重受阻，成骨向分化标志物DMP1、DSPP 的表达仅为对照组的20%，基质沉积和矿化亦显著减少，前牙本质的厚度仅为对照组的二分之一。提示蛋白聚糖的结构和功能完整性对于DPSCs 的成骨分化必不可缺，而蛋白聚糖作为成骨分化中重要的调控分子，它的种类及分布具有明显的组织特异性。OMD 是一种仅存在于矿化组织内的蛋白聚糖，其C 端结构域对羟基磷灰石有着高亲和力。在hDPSCs 的成骨分化后期OMD 的表达显著上调35 倍，研究者们进一步通过shRNA 沉默OMD 的表达后，shOMD⁃hDPSCs组的成骨标志物表达水平仅为对照组的三分之一，并且无法形成矿化结节［11］。由此可见蛋白聚糖不仅参与了hDPSCs 的成骨向分化，亦是基质矿化的重要调控分子。

同样，外源性的HEP 具有促进hDPSCs 成骨向分化的潜力，可显著上调成骨标志物BMP⁃2、ALP、OC 的转录水平，促进矿化结节的形成。HEP 良好的组织相容性和成骨潜力使其有望成为直接盖髓术的新材料［24］。目前关于蛋白聚糖在牙源性干细胞成骨向分化中的调控作用的探讨仍处于初级阶段，深入阐明蛋白聚糖对牙源性干细胞的成骨调控作用将有助于推动引导骨组织再生、材料学等领域的发展。

2.3 蛋白聚糖调控间充质干细胞成骨分化的作用机制骨形成是长期的动态过程，多条通路的相互作用和精准的时空表达是骨发育再生中必不可少的。蛋白聚糖上的多种GAGs 链（如HS、CS）广泛参与间充质干细胞成骨分化所涉及的信号传导。FUKUNISHI 等［25］发现MC3T3⁃E1 细胞在成骨分化过程中所表达的GAGs 对FGF2 以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）⁃2 的亲和力显著上升，有助于GAGs 结合并稳定这些生长因子，从而稳定地调控成骨相关信号通路的传导。

HS 亦能够促进BMP⁃2 和其受体的结合，同时降低头蛋白（Noggin）对该通路的拮抗作用，促进pSMAD 的激活，从而促进成骨［26］。HEP 可与Wnt3a相互作用，进而激活肌醇磷脂⁃3⁃激酶（phosphati⁃dylinositol⁃3⁃kinases，PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（protein⁃serine⁃threonine kinase，AKT）信 号通路，并且通过Runt 相关转录因子2（runt⁃related transcription factor 2，RUNX2）促进ALP 的活性，从而发挥促进成骨向分化的作用［27］。除此之外，HEP 亦可正向调节BMP 信号通路活性，同时下调Wnt 通路抑制物Dickkopf1（DKK1）和骨硬化蛋白（Sclerostin，SOST）的表达从而促进hMSCs 的成骨分化。

CS 是构成骨基质最主要的GAGs 之一，其表达水平随着MSCs 的成骨分化明显上调，其中高硫酸化的硫酸软骨素⁃E（Chondroitin sulphate E，CS⁃E）的表达水平显著上升，CS⁃E 能够与BMP4 作用促进细胞成骨分化和基质矿化［28］。研究还发现CS⁃E亦可与上皮型钙黏蛋白（E⁃cadherin）、神经型钙黏蛋白⁃11（cadherin⁃11）结合，降低ERK1/2 的磷酸化，激活SMAD3 和SMAD1/5/8，促进成骨分化［29］。

近年来，有学者提出不同结构的GAGs 能够影响细胞内外的信号传导。HA 是结构最简单的GAGs，不经过硫化以游离或非共价复合体形式参与信号传导调控细胞的生物学活动。ZHAO 等［30］在兔MSCs的体外培养发现，高分子量HA能有效促进兔MSCs 的成骨分化，同时MSCs 形成的钙结节量随HA的分子量升高而增多。虽然其具体作用机制尚不明确，但研究者认为可能与HA 改变BMP 通路传导有关，HA 通过下调BMP⁃2 的拮抗Noggin 和卵泡抑素（Follistatin）的表达，增强BMP 通路活性从而促进MSCs 的成骨分化能力［31］。但KANEKO等［32］发现高分子量HA 在低浓度下能够通过与CD44 结合抑制BMP⁃2 诱导的成骨分化，并下调SMAD1/5/8 的磷酸化水平，提示HA 的分子量与浓度可能存在交互作用。

3 蛋白聚糖在骨组织工程中的应用

蛋白聚糖作为天然的细胞外基质成分，具有良好的生物相容性、可降解性、无免疫原性等特点，是目前骨组织工程材料的研究热点。通过对蛋白聚糖、GAGs 与多种材料进行修饰及交联，能够显著提高材料的性能，并且将材料制备成便于使用的各种形式。

将GAGs 与合适的生物材料进行复合，模拟骨组织天然细胞外基质结构，从而进一步提高其促成骨作用是目前研究的一大热点。大量研究将CS、HS、HA 等与胶原蛋白、壳聚糖、钛板等材料进行复合，制成复合支架、水凝胶等形式的材料，在动物实验中均表现出优越的促成骨作用［21，33］。在一项前瞻性临床研究中，LORENZ 等［33］将HA 和β⁃磷酸三钙混合制成可注射的骨替代物，该材料不仅具有足够的机械强度，还具有良好的骨引导能力，可以用于促进患者拔牙窝的骨再生，为后期的种植手术提供有利的骨量基础，该研究纳入21 例患者，行牙拔除术后均在拔牙窝内注射该新型骨替代物。在4 个月的愈合期后，形态学和骨计量学检查表面发现所有患者的牙槽窝内均有大量新骨形成，且后续种植体的一年存活率达到100%。水凝胶型HA/β⁃磷酸三钙骨替代物能够明显减少愈合初期结缔组织的长入，其多孔结构更是为成骨细胞的长入和后续骨基质的生成沉积提供了良好的机械基础。HA 在材料中的应用亦能加速内源性成骨细胞的募集并促进成骨作用，极大提升材料的生物学特性。目前，GAGs 已被广泛运用到骨移植替代材料中，显著改善了移植材料的生物活性，有效地促进成骨作用，在临床上具有广阔的应用前景。

此外，GAGs 可结合并调控生长因子的活性，提高其生物利用度，作为生长因子的替代或补充，解决骨再生中生长因子应用昂贵、释放不稳定的缺点，为骨组织工程中生长因子的递送系统提供了更优良的策略，达到更好的促进骨再生效果。CS⁃GAG 和HS⁃GAG 作为BMP⁃2 的载体，均能显著延长BMP⁃2 的释放时间［34-35］。还有研究者合成出与BMP⁃2 具有高亲和力的HS3，添加了HS3 的复合支架能够显著维持BMP⁃2 的生物活性，在27 d 后支架内的BMP⁃2 含量仍有初始含量的58%，是对照组的三倍，显著促进了细胞的成骨分化［36］。由此可见，利用GAGs 与生长因子的高亲和力，能够构建生长因子控释系统的复合支架材料，从而为骨组织工程提供新的思路。

4 结论与展望

目前，利用间充质干细胞介导骨组织再生的研究是生命科学领域的热点，如何精准调控干细胞稳态，以最大程度发挥其成骨向分化潜能是未来骨组织再生研究的重点。因此，深度揭示干细胞所处微环境对其自我更新和成骨分化动态平衡的影响显得尤为重要。蛋白聚糖是构成间充质干细胞微环境的主要成分，广泛存在于真核细胞的细胞外基质中，参与了间充质干细胞成骨向分化的调控。目前临床研究已发现蛋白聚糖缺陷可导致数种骨组织发育异常的遗传性疾病，基础研究也揭示了蛋白聚糖是干细胞稳态调控的重要信号分子，其GAGs 上的硫酸化基团也是参与信号传导和成骨调控的重要功能域，其潜在的作用机制研究尚处于初级阶段，深入揭示明确蛋白聚糖对干细胞成骨分化的调节机制，将有利于在未来对干细胞进行精准的定向化调控，从而促进成骨分化的临床应用和相关骨缺损的治疗。