菌根真菌和根瘤菌接种对紫花苜蓿和无芒雀麦混播牧草生物量的影响

2021-01-09谢开云孙伶俐张力文郑万菊万江春

草地学报 2021年1期

谢开云，孙伶俐，张力文，郑万菊，万江春，赵云

(1. 西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室，新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2. 阜康市草原站，新疆阜康 831500； 3. 中国牧工商集团有限公司，北京 100070)

豆科/禾本科(简称豆/禾)牧草混播草地以其较高的生产力、较好的营养搭配和经济有效的氮素来源在畜牧业发展中占据重要的地位。建植高效优质的豆科/禾本科牧草混播草地，对于解决当前畜牧业转型发展中饲料粮短缺问题及实现农牧业可持续发展具有重要意义。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)和根瘤菌是自然界存在的两类重要的共生微生物，分别能够与宿主植物形成丛枝菌根和根瘤。AMF和根瘤菌既能单独生存于宿主植物根部，也能共同协作形成二菌一宿主的三重共生体系[1]。两类菌株能促进植株在贫瘠土地中对氮、磷等营养元素的吸收，改善宿主植物的生长状况[2-5]。目前国内外关于菌根真菌和根瘤菌双接种的研究主要集中单作作物(如大豆(GlycinemaxL)[6-7]和蚕豆(ViciafabaL)[8-9])、间作作物(如玉米(ZeamaysL)/大豆[10]和玉米/蚕豆[11])、多年生牧草(如紫花苜蓿(MedicagosativaL)[12-14])，而对豆禾混播草地的研究鲜有报道。在混播草地中，对于禾本科牧草而言，可以形成菌根真菌-禾本科牧草两重共生体，对豆科牧草而言，可以形成菌根真菌-豆科植物-根瘤菌三重共生体[15]，然而微生物介导的共生体在牧草生长中的所起的作用及贡献仍不清楚。因此，本研究以单播与混播的紫花苜蓿和无芒雀麦为研究对象，通过研究丛枝菌根真菌和根瘤菌接种对混播中紫花苜蓿和无芒雀麦牧草生长的影响，以期为混播草地的建植和制定科学的管理措施提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为紫花苜蓿(Medicagosativa，‘新苜4号’品种，新疆农业大学牧草遗传育种实验室提供)和无芒雀麦(BromusinermisLeyss，‘乌苏1号’品种，乌苏市草原站提供)。试验用盆内口径为22.5 cm，底径为20.5 cm，高为28 cm的加厚树脂塑料盆，每盆装风干土25 kg。供试土壤为粘土，取自新疆农业大学三坪农业综合试验站试验地0～30 cm表层土，土壤田间持水量为26%，容重为1.32 g·cm-3。供试土壤理化性质为：土壤有机质含量为1.68 g·kg-1，pH值为7.6，全氮含量为1.16 g·kg-1，碱解氮含量为26.57 mg·kg-1，全磷含量为0.64 g·kg-1，速效磷含量为5.92 mg·kg-1，全钾含量为16.31 g·kg-1，速效钾含量为154.34 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验采用双因素完全随机区组设计，设置T处理为4个灭菌土壤接菌，即不接种菌(CK)，接种根瘤菌(R)，接种菌根真菌(F)，根瘤菌和菌根真菌双接种(FR)；M处理为3个种植方式，即紫花苜蓿单播(A)，无芒雀麦单播(S)，紫花苜蓿和无芒雀麦1∶1混播(AS)。共12个处理，每个处理重复3次，试验共计36盆。

试验于2019年4月25日将紫花苜蓿和无芒雀麦用育苗盘在培养箱内育苗培养一周。选择大小和表型一致的强壮苗，分3种模式(无芒雀麦单播、紫花苜蓿单播、无芒雀麦和紫花苜蓿混播)移栽到塑料桶里。每盆定苗4株，单播时等距分布，混播时保持1∶1比例对角等距分布。利用土壤含水量测定仪(WET Sensor HH2)监测土壤表层8 cm的体积含水量，均值低于15%时，对所有处理浇2 000 mL自来水。手工防除杂草，每盆挂粘虫板来防除虫害。

1.3 测定指标与方法

地上和地下生物量的测定：于2019年10月对所有盆进行刈割(混播处理分种刈割)，并称其鲜重(g)，随后取其根系，用自来水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分，称其鲜重。地上和地下部分装纸袋放置烘箱在105℃下杀青0.5 h，在65℃烘48 h至恒重，称其干重(g)。

分蘖数(分枝数)测定：在取样前，对紫花苜蓿和无芒雀麦分枝/蘖数进行统计。单播时将每盆内4株无芒雀麦的分蘖数(紫花苜蓿的分枝数)平均值作为一个测定值，混播时将2株无芒雀麦(2株紫花苜蓿)的均值作为一个测定值。

相对叶绿素含量(Soil and plant analyzer develotrnent，SPAD)：用SPAD-502叶绿素计在取样前测量紫花苜蓿和无芒雀麦叶片的SPAD值，被测紫花苜蓿叶片选最上部的完全展开叶，无芒雀麦选取最上部的完全展开叶(第3片叶)。每种植物测定5片叶，求其平均值。

株高测定：在取样前，测定每盆内无芒雀麦和紫花苜蓿的株高，单播时将每盆内4株平均值作为一个测定值，混播时将2株的均值作为一个测定值。

1.4 数据处理

所有数据采用Excel 2013进行数据整理和汇总，用Graph Pad Prism 7.0软件进行制图，SAS 9.0软件统计分析。用PROC GLM程序对单播和混播种植的紫花苜蓿和无芒雀麦的干物质生物量、株高、分枝/蘖数和SPAD进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同接种处理对混播系统牧草株高的影响

对不同接种处理下单播和混播的紫花苜蓿和无芒雀麦地上和地下单株干物质生物量、株高、分枝/蘖数和SPAD值进行GLM方差分析(表1)，结果表明：不同接种处理对紫花苜蓿和无芒雀麦地上和地下单株干物质生物量具有显著影响(P<0.001)，紫花苜蓿和无芒雀麦地上和地下干物质生物量在单播和混播两种种植方式间也具有极显著差异(P<0.001)。接种处理和混播方式之间的交互效应对紫花苜蓿和无芒雀麦地上干物质生物量、株高、分枝/蘖数及SPAD值均无显著影响。

表1 不同处理下紫花苜蓿和无芒雀麦生物量、株高、分枝/蘖数和SPAD值的方差分析Table 1 Analysis of variance of biomass,plant height,number of branches/tillers and SPAD values of alfalfa and smooth brome under different treatments

在单播和混播处理下，接种根瘤菌、菌根真菌以及根瘤菌和菌根真菌双接种处理对紫花苜蓿和无芒雀麦的株高均无显著影响(图1A和1B)。另外，单播的紫花苜蓿株高显著高于混播(|t|=4.860，P=0.0028)，而在混播中的无芒雀麦株高显著高于单播(|t|=6.906，P=0.0005)。

2.2 不同接种处理对混播系统牧草对分枝/蘖的影响

对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦的分枝数和分蘖数进行分析，结果表明：在单播和混播处理中，接种根瘤菌、菌根真菌以及根瘤菌和菌根真菌双接种处理下紫花苜蓿的分枝数与对照均无显著差异(图2A)。接种根瘤菌、菌根真菌以及根瘤菌和菌根真菌双接种处理对单播中无芒雀麦的分蘖数无显著差异(图2B)，而接种菌根真菌处理下混播中的无芒雀麦的分蘖数显著高于对照(图2B，P<0.05)。另外，单播的紫花苜蓿的分枝数显著高于混播(|t|=4.134，P=0.0257)，而无芒雀麦的分蘖数在单播和混播处理下无显著差异(|t|=1.853，P=0.1609)。

图1 不同接种处理对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦株高的影响Fig.1 Effects of different inoculation treatments on plant height of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing注：图A代表单播和混播处理下的紫花苜蓿；图B代表单播和混播处理下的无芒雀麦。不同的大写字母表示单播不同接种处理下具有显著差异(P<0.05)，不同小写字母表示混播中不同接种处理下具有显著差异(P<0.05)，下同；CK，R，F和FR分别表示试验对照、接种根瘤菌、接种菌根真菌和根瘤菌和菌根真菌双接种Note:Figure A represents alfalfa in pure and mixed sowing,and figure B represents smooth brome in pure and mixed sowing. Different capital letters indicated that there are significant differences in pure sowing under different inoculation treatments at the 0.05 level;different lowercase letters indicated that there are significant differences under different inoculation treatments in mixed sowing at the 0.05 level,the same as below. CK,R,F and FR represents control,Inoculated rhizobium,Inoculated mycorrhizal fungi and Inoculated rhizobium and mycorrhizal fungi,respectively

图2 不同接种处理对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦分枝/分蘖数的影响Fig.2 Effects of different inoculation treatments on the number of branches/tillers of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing

2.3 不同接种处理对混播系统牧草SPAD值的影响

对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦的SPAD值进行分析，结果表明：单播紫花苜蓿的SPAD值在接种根瘤菌和双接种处理下显著高于对照和单独接种菌根真菌处理(图3A，P<0.05)，而在混播种植下紫花苜蓿的SPAD值在接种根瘤菌、菌根真菌及双菌接种处理与对照物无显著差异(图3A)。单播的无芒雀麦的SPAD值在接种菌根真菌处理下显著高于对照(图3B，P<0.05)，而在混播种植下无芒雀麦的SPAD值在接种根瘤菌、菌根真菌及双菌接种处理与对照物无显著差异(图3B)。另外，单播的紫花苜蓿的SPAD值显著高于混播(|t|=4.491，P=0.0206)，而混播中无芒雀麦的SPAD值显著高于单播(|t|=4.605，P=0.0193)。

图3 不同接种处理对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦SPAD值的影响Fig.3 Effects of different inoculation treatments on SPAD values of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing

2.4 不同接种处理对混播系统紫花苜蓿根瘤数量的影响

由图4可知，接种根瘤菌处理的紫花苜蓿根系根瘤菌数量远远高于不接种根瘤菌的处理，如单播的紫花苜蓿的根瘤菌数量在R和FR处理分别为60.33和38.00个·株-1，在CK和F处理下分别为2.33和3.00个·株-1。同样混播中的紫花苜蓿的根瘤菌数量在R和FR处理分别为43.00和51.67个·株-1，在CK和F处理下分别为2.33和3.00个·株-1；在R处理下紫花苜蓿的根瘤菌数量在单播和混播之间无显著差异，在FR处理下混播中的紫花苜蓿的根瘤菌数量极显著高于单播(P<0.01)。

图4 不同接种处理对单播和混播中的紫花苜蓿根瘤菌数量的影响Fig.4 Effects of different inoculation treatments on the number of rhizobia in alfalfa in pure sowing and mixed sowing注：**表示单播与混播之间差异极显著(P<0.01)Note:** indicated that there was a significant difference between pure sowing and mixed sowing at the 0.01 level

2.5 不同接种处理对混播系统牧草生物量的影响

与对照相比，单独接种根瘤菌(R)和同时接种根瘤菌和菌根真菌(FR)处理对单播紫花苜蓿单株地上干物质生物量(DMY)均具有显著影响(图5A，P<0.05)；单独接种菌根真菌(F)对单播的紫花苜蓿单株地上干物质生物量具有促进作用，但未达到显著水平；与单独接种菌根真菌(F)处理相比，同时接种根瘤菌和菌根真菌(FR)处理下单播的紫花苜蓿的单株地上干物质生物量显著增加(图5A，P<0.05)。在混播中同时接种根瘤菌和菌根真菌(FR)处理下紫花苜蓿单株干物质生物量显著高于对照和单独接种菌根真菌(F)处理(P<0.05)，但在CK，R和F处理之间无显著差异(图5A)。

在单播和混播处理中，单独接种根瘤菌(R)和同时接种根瘤菌和菌根真菌(FR)处理下紫花苜蓿单株地下干物质生物量显著高于对照和单独接种菌根真菌处理(F)(P<0.05)，F处理显著高于对照(图5C，P<0.05)，而在单播中FR处理显著高于R处理(P<0.05)，在混播中无显著差异。在单播和混播处理中，接种菌根真菌处理(F)的无芒雀麦单株地上和地下干物质生物量显著高于对照(图5B和图5D，P<0.05)。另外，混播中紫花苜蓿的单株地上和地下干物质生物量均显著低于单播中的紫花苜蓿(表1，P<0.0001)，而混播中的无芒雀麦的单株地上和地下干物质生物量却显著高于单播中的无芒雀麦(表1，P<0.0001)。

图5 不同接种处理对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦干物质生物量的影响Fig.5 Effects of different inoculation treatments on dry matter biomass of individual alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing注：A和B分别代表紫花苜蓿和无芒雀麦的地上干物质生物量；C和D分别代表紫花苜蓿和无芒雀麦的地下干物质生物量。Note:Fig. A and B represent the aboveground dry matter biomass of alfalfa and smooth brome respectively,and C and D represent the belowground dry matter biomass of alfalfa and smooth brome respectively.

在单播种植的紫花苜蓿的单株地上生物量显著高于混播种植(|t|=4.491，P=0.0206)，单株地下生物量高于混播种植，但未达到显著水平(|t|=3.113，P=0.0527)。混播种植的无芒雀麦的单株地上和地下生物量显著高于单播种植(地上生物量：|t|=5.426，P=0.0123；地下生物量：|t|=3.304，P=0.0456)。

在对照(CK)和单独接种菌根真菌(F)处理下，紫花苜蓿和无芒雀麦混播的地上和地下总生物量显著高于紫花苜蓿，却显著低于无芒雀麦。在接种根瘤菌的处理中(包括R和FR处理)，紫花苜蓿和无芒雀麦混播的地上总生物量却显著低于紫花苜蓿和无芒雀麦单播时的地上总生物量(图6A，P<0.05)。在同时接种根瘤菌和菌根真菌(FR)处理下，紫花苜蓿和无芒雀麦混播的地上和地下总生物量显著低于紫花苜蓿和无芒雀麦单播时的地上和地下总生物量(图6B，P<0.05)。

图6 不同接种处理对单播和混播中的紫花苜蓿和无芒雀麦总生物量的影响Fig.6 Effects of different inoculation treatments on the total biomass of alfalfa and smooth brome in pure and mixed sowing

3 讨论

不论何种接种处理，紫花苜蓿的生长(主要包括株高、分枝数、SPAD值、地上和地下单株生物量)在单播种植中总是优于混播种植，而无芒雀麦与之相反，在混播种植中总是优于单播种植[16]。主要原因可能是在混播中豆科植物对伴生植物地下氮素的转移，导致混播中禾本科牧草生物量产量要高于单播的禾本科牧草[17-18]。另外，不论是地上还是地下总生物量，混播种植的生物量总是介于两种牧草单播生物量之间，这与以前的研究结果一致[19]。Trenbath研究了344个二元结构的混播的产量，数据显示混播草地的产量一般介于两个物种单播的生物量之间，但高于两种单播模式产量的均值[20]。Sturludóttir研究也表明通常情况下在豆禾混播草地中混播的产量都会小于高产单播的产量[21]。

本研究中，与对照相比，单独接种根瘤菌处理下单播和混播种植的紫花苜蓿地上单株生物量分别提高了65.42%和53.41%，地下单株生物量分别提高了96.66%和114.42%，这与宁国赞研究结果一致[22]。单独接种菌根真菌显著促进了单播和混播种植的紫花苜蓿的生长，特别是地上单株生物量分别提高了35.33%和23.20%，地下单株生物量分别提高了40%和46.45%，其主要原因可能是接种根瘤菌可显著提高豆科植物的生物固氮量，AMF提高植物吸收磷和其他养分的能力[6，23]。菌根真菌和根瘤菌双接种处理也显著促进了单播和混播种植的紫花苜蓿的生长，其中地上单株生物量分别提高了105.66%和185.64%，地下单株生物量分别提高了167%和121%。因此，本研究认为同时接种AMF和根瘤菌对紫花苜蓿促进作用具有协同效应。Abd-Alla等研究也表明AMF和根瘤菌双重接种对促进蚕豆(V.fabaL.)的生长更为有效[24]。AMF与根瘤菌双接种对宿主的促进效果优于单接种，主要是因为双接种能明显促进宿主植物生长，改善其养分利用状况(特别是磷素)[25-26]，提高土壤有机磷的利用率和根瘤菌的固氮能力[6]，并最终促进宿主植物的生长发育[27-29]。

与对照相比，菌根真菌和根瘤菌双接种处理下单播和混播种植的无芒雀麦地上单株生物量分别提高了44.39%和48.82%，地下单株生物量分别提高了24.18%和15.22%。而单独接种菌根真菌处理下单播和混播种植的无芒雀麦地上单株生物量分别提高了33.78%和43.40%，地下单株生物量分别提高了43.40%和65.05%。可见双接种对无芒雀麦的生长没有明显的协同促进作用，主要是因为接种根瘤菌对无芒雀麦的生长没有影响，这与Meng等在玉米上的研究结果不一致，他的研究认为接种根瘤菌对间作中的玉米也存在显著的促进作用，其主要原因是植物根际促生根瘤菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)可增强非固氮植物非共生性N2固定、养分吸收以及与有害微生物的竞争力[10，30-31]。植物根际促生菌对植物的促进作用主要是由于该菌群能促进植物根系的生长发育，进而促进植物对土壤中水分和矿质养分的吸收利用所致[32]，在本研究中供试土壤经过灭菌后再接种处理，土壤中的微生物主要为接种的根瘤菌或菌根真菌，比较单一的菌群可能是造成对无芒雀麦没有促进作用的主要原因。