核桃蛋白的组成、制备及特性研究进展

豁银强 刘传菊 聂荣祖 周 睿 包鸿慧 汤尚文

(湖北文理学院，襄阳 441053)

核桃是世界上种植面积最广的木本坚果，主要种植区域分布在南欧、北非、东亚、美国及南美西部[1]。从FAO统计数据来看，核桃种植面积不断增加，从1998年的561 977 ha到2018年的1 159 484 ha，10年间种植面积增加了1倍多。2018年世界核桃总产量为3 662 507 t，中国是世界上核桃产量最多的国家，年产量达到1 586 367 t，随后是美国、伊朗和土耳其，年产量分别为613 260、409 562和215 000 t。核桃仁的营养成分主要是油脂和蛋白质，分别占干物质的55%～70%和18%～24%[2,3]。核桃蛋白含18种氨基酸，包括人体所需的8种必需氨基酸，核桃蛋白的氨基酸组成非常平衡，显示出一系列营养与保健功能。核桃蛋白主要是核桃油生产加工的副产物，由于主要组分谷蛋白的溶解性差，核桃蛋白在食品领域的应用非常有限，大多作为饲料或被废弃，造成了核桃蛋白资源的极大浪费。为了提高核桃蛋白的溶解性，扩大其在食品领域中的应用，人们从生产工艺、蛋白改性等方面进行了系列的研究。

1 核桃蛋白质的组成及结构

1.1 核桃蛋白质组成

根据溶解性差异，核桃蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其分别占总蛋白的6.8%、17.6%、5.3%和70.1%[4]，谷蛋白是核桃蛋白质的主要组分。在非还原SDS-PAGE图谱上，核桃蛋白呈现9条明显的条带。在还原SDS-PAGE图谱上，核桃蛋白呈现至少11条不同的条带，在分子质量20、31 ku和40 ku附近的条带比较明显，一些染色较弱的条带出现在分子质量14.4～66.2 ku之间。非还原SDS-PAGE图谱上，主要的条带出现在分子质量40～60 ku之间，其是分子质量40～45、20～25 ku及25～30 ku的多条肽链通过二硫键连接的多肽链蛋白。在还原和非还原SDS-PAGE图谱上31～43 ku之间均出现一个染色弱的条带，表明该条带之间没有链间二硫键[5]。在还原SDS-PAGE图谱上，白蛋白在分子质量10～75 ku区出现比较宽广的条带分布，主条带出现在分子质量20.1 ku；球蛋白条带主要出现在30～35 ku和17～22 ku之间，其可能分别是11S glycinin的酸性亚基和碱性亚基，在50～72 ku区间的条带主要是7 S conglycinin 蛋白；谷蛋白主要包括分子质量大于200、50～60、30～35 ku和17～20 ku四种类型的条带[6]。醇溶蛋白在还原和非还原SDS-PAGE图谱上均未出现明显的条带[5]。核桃蛋白粉、核桃蛋白浓缩物及核桃蛋白分离物的SDS-PAGE图谱没有明显的差异，表明碱提等电点沉淀对核桃蛋白质的组成没有明显的影响[7]。

利用高效液相排阻色谱对核桃蛋白进行分析表明，核桃蛋白粉主要包括18 824、96.99 ku和3.83 ku三种分子大小组分，其中分子质量18 824 ku的组分可能是蛋白分子聚集体。核桃蛋白浓缩物含16 725、104.943、7.3 ku和2.6 ku四种分子大小的组分，其比例分别为0.8%、63.9%、11.4%和23.9%。核桃蛋白分离物主要包含1种分子质量106.33 ku的组分[7]，碱法制备过程中亚基间的二硫键被破坏，因而没有出现大分子聚集体[8]。

1.2 核桃蛋白质氨基酸组成

氨基酸组成是蛋白质的重要化学特征，决定它的营养价值。可能是由于品种间的差异，不同文献报道核桃蛋白的氨基酸组成略有不同。由于制备方法不同，核桃蛋白粉、核桃蛋白浓缩物及核桃蛋白分离物的氨基酸组成也存在一定的差异。表1为核桃蛋白粉、核桃蛋白浓缩物和核桃蛋白分离物的氨基酸组成[7]。核桃粉的赖氨酸和苯丙氨酸含量高于核桃蛋白浓缩物和核桃蛋白分离物，这可能是由于制备过程中破坏了一些氨基酸残基。核桃蛋白产品均含有较高的谷氨酸，其次是精氨酸和天冬氨酸，其含量分别达到22.94、10.14、14.88 g/100 g脱脂蛋白[9]。相比于FAO/WHO对成年人的推荐模式，核桃蛋白仅甲硫氨酸含量不足，可见对成年人而言核桃蛋白是一种良好的必需氨基酸源，也是具有高营养价值的植物蛋白源[10]。相比于FAO/WHO推荐模式，核桃分离物的组氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸均超过了2～5岁学前儿童的需要标准，而赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的含量仅为需求量的43.1%～94.1%，赖氨酸是核桃蛋白分离物的第一限制氨基酸，其含量仅为推荐量的43.1%～44.8%[11]。

表1 核桃蛋白粉、核桃蛋白浓缩物和核桃蛋白分离蛋白的氨基酸组成(g/100 g蛋白)[7]

1.3 核桃蛋白的二级结构

脱脂核桃粉与核桃蛋白浓缩物及核桃蛋白分离物的远紫外圆二色谱图有所不同。通过拟合分析，脱脂核桃蛋白粉二级结构组成中α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲的含量分别为80.4%、4%、5.7%和15.3%。核桃蛋白浓缩物和核桃蛋白分离物的二级结构组成类似，其α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲的含量分别为34.9%、11%、23.3%和32%[8]。由于提取过程中对蛋白质有序结构造成一定程度的破坏，相对于脱脂核桃蛋白粉来说，核桃蛋白浓缩物和核桃蛋白分离物含有更多的β转角和无规则卷曲，而结构紧密的α螺旋结构含量相对较低。Zhu等[12]研究核桃蛋白分离物时得到类似的结果，即α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲的含量分别是35.9%、11.3%、23.4%和29.4%，超声处理使α螺旋结构减少而β折叠、β转角及无规则卷曲的含量均不同程度增加。提取方法对核桃蛋白二级结构也有一定的影响，相对于常规碱法提取，超声辅助碱法提取使核桃蛋白分离物的α螺旋含量降低，而β转角、β折叠及无规则卷曲结构含量均增加[11]。水提白蛋白的α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲结构含量分别为27.8%、53.65%、0%和18.55，5%NaCl提取球蛋白的四种结构分别为14.49%、37.32%、26.90%和21.29%，75%乙醇提取醇溶蛋白的分别为35.68%、30.09%、18.70%和15.52%，0.1 mol/L NaOH提取谷蛋白的四种结构分别为17.38%、41.89%、30.64%和10.06%。利用二(2-乙基已基)丁二酸酯磺酸钠反胶束提取白蛋白的α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲的含量分别为28.18%、37.61%、12.05%和22.15%，球蛋白的为32.17%、26.06%、12.10%和35.78%，醇溶蛋白的为36.16%、36.40%、14.41%和13.04%，谷蛋白的为11.35%、41.25%、20.44%和26.95%[13]。

2 核桃蛋白的制备

核桃蛋白主要利用提取油脂产生的副产物核桃粕进行加工制备。根据蛋白质含量不同，核桃蛋白分为3大类：蛋白含量小于60%的核桃蛋白粉、蛋白含量高于70%的核桃浓缩蛋白及蛋白含量高于90%的核桃分离蛋白[14]。

2.1 核桃蛋白粉

核桃蛋白粉主要是提取油脂后产生的副产物经干燥及微细化等处理获得的高蛋白产品。常用制备油脂的方法有液压挤压、螺杆挤压、有机溶剂、超临界CO2浸提，以及先压榨然后再用溶剂浸提的联用方式[15]。不同方式所得蛋白粉的蛋白质含量及油脂残留量不同。相对物理压榨来说，溶剂浸提所得蛋白粉的油脂残留量低而蛋白质含量高，螺杆挤压所得蛋白粉比液压挤压所得产品的蛋白质含量高而油脂残留低。液压挤压联合溶剂浸提或固液浸提能进一步提高蛋白质的含量而降低油脂的残留量，其蛋白含量与直接溶剂提取相当[16]。油脂含量越低，蛋白粉的白度越高而色度越好。液压挤压温度较高时，酚类物质发生氧化及还原糖与氨基发生美拉德反应使颜色加深。由于在提取油脂过程中所受机械力、温度及处理强度不同，所得蛋白质的组成、结构及功能性质也有所差异。

2.2 核桃蛋白浓缩物

通常利用脱脂蛋白粉进行制备植物蛋白浓缩物，一般采用乙醇浸提、酸浸出及湿热使蛋白质变性，然后经水洗去除灰分、寡糖及一些微量组分，从而提高蛋白质的纯度。蛋白质和多糖不溶于乙醇溶液，利用60%～95%的乙醇洗涤脱脂蛋白粉去除小分子糖类及其他可溶性化合物，然后经干燥得蛋白浓缩物。酸浸出法是利用与主要蛋白组分等电点pH相同的酸性溶液洗涤脱脂蛋白粉，去除小分子糖及一些可溶性微量组分，然后经中和、干燥得到蛋白浓缩物。通过湿热使脱脂蛋白粉中的蛋白质变性降低其溶解度，然后进行水洗去除小分子糖及其他可溶性组分，获得蛋白浓缩物。这些方法通常能使蛋白质含量达到70%以上，但不同方法制备蛋白浓缩物的物理特性差异较大。酸浸出法获得的蛋白浓缩物溶解度比乙醇浸提及湿热-水洗法制备的高。由于浓缩过程中去除了一些风味物质及色素组分，蛋白浓缩物的色泽和风味比蛋白粉好。周苗苗在优化条件下利用乙醇浸提核桃浓缩蛋白的提取率达87.07%，蛋白含量为69.24%[14]。

2.3 核桃蛋白分离物

蛋白分离物是精制程度最高的蛋白产品，其蛋白质质量分数达90%以上，其在去除蛋白质浓缩物制备过程中的小分子糖及可溶性微量组分外，还将一些不溶性多糖去除。主要采用碱性溶液浸提脱脂蛋白粉，去除包括不溶性多糖及蛋白等不溶性成分。将含有大多数蛋白及小分子糖的上清液pH调至4.5左右使蛋白质沉淀，通过离心或过滤去除含有小分子糖、灰分及其他微量组分的上清液。沉淀经洗涤、干燥得蛋白分离物。通常在干燥之前对蛋白进行中和，该法获得的蛋白质分离物在水中的分散性较好。邸红艳等利用超声辅助碱法提取核桃蛋白的得率达到71%[17]。

3 核桃蛋白功能特性

3.1 溶解性

溶解性是蛋白质的重要功能特性，其对蛋白质乳化特性、发泡特性等有重要影响。pH、溶剂类型和温度等因素对核桃蛋白质的溶解性有较大影响。核桃蛋白在碱性溶液中的溶解度较高，在70%乙醇溶液中的溶解度最低，在55 ℃时的溶解度最大[4]，温度超过55 ℃后，由于蛋白质变性溶解度会逐渐下降[18]。核桃中的酚醛类物质通常能与蛋白质形成复合物，进而降低核桃蛋白在水及稀盐溶液中的溶解度[19]。通过热水处理去除核桃中的单宁，脱脂核桃粉的球蛋白溶出率从15%提高至20%，表明球蛋白因与单宁发生复合溶解度降低[20]。

3.2 乳化特性

核桃蛋白的乳化性与溶解度密切相关，并受蛋白质浓度、温度等外界条件影响。核桃蛋白质在碱性溶液中乳化性较好，在等电点乳化性最差，在0～0.5 mol/L NaCl的溶液中，乳化性随盐溶液浓度升高而增加，在0.5～1 mol/L NaCl 溶液中，乳化性随盐溶液浓度升高而减弱[21,22]。制备方法对乳化特征也有一定的影响，相对于常规碱法处理，超声辅助碱法制备核桃蛋白分离物的乳化性提高34.5%[11]。

3.3 其他特性

目前，关于核桃蛋白质功能特性方面的研究主要集中在溶解性和乳化性方面，其他功能特性研究报道比较少。丁晓雯等[23]发现核桃蛋白的起泡性和泡沫稳定性、黏度、热稳定性、持水力等功能性质受温度、加热时间及pH的影响。核桃蛋白的持水力、起泡性和泡沫稳定性在pH5.0时最弱；当 NaCl 浓度为 0.6 mol/L，核桃蛋白在40 °C时的持水力最强；NaCl能提高发泡力，但会使泡沫的稳定性降低。

4 核桃蛋白的改性

核桃蛋白因溶解性差，进而导致其乳化性、发泡性、胶凝性等功能特性不佳，限制了其在食品领域的应用。为了拓展核桃蛋白在食品及其他领域中的应用，需要对其进行改性以提高其功能特性，进而开发具有不同功能特性的专用核桃蛋白产品。

4.1 物理改性

物理改性是指通过超声、剪切、辐照、高压、电场及添加小分子双亲物质等方法来改善蛋白质的功能特性。物理改性具有成本低、无毒副作用、对营养价值影响小及易于工业化实施等优点，目前越来越受人们的青睐。高强度超声处理不会破坏核桃蛋白分离物的共价键，但使其空间结构发生解聚、伸展，导致其变性温度和变性焓降低。由于引起聚集体解聚及空间结构改变，高强度超声处理使核桃蛋白分离物的溶解度、乳化活性指数及乳化稳定性均提高[12]。在60 °C温度下15 000 r/min高速剪切5 min使核桃蛋白在pH 8.0和pH 9.0溶液中的溶解度分别从24.33%增加到62.81%和50.93%增到76.65%，同时伴随着粒径减小[24]。电子束辐照使核桃蛋白分子发生聚集或交联，导致其变性温度升高及热稳定增加[25]。

4.2 化学改性

化学改性是通过化学手段在蛋白质中引入各种功能基团，如亲水亲油基团、二硫键、带负电荷基团等。利用蛋白质侧链基团的化学活性改变蛋白质的结构、静电荷和疏水性，以此达到改善蛋白质功能特性的目的。关于核桃蛋白化学改性的报道相对较少。传统加热和超声两种方式对核桃分离蛋白进行麦芽糊精接枝改性均能提高核桃蛋白分离物的溶解度、乳化性及乳化稳定性，超声辅助能增加核桃蛋白分离物的接枝度。脂质过氧化物、烷过氧自由基(ROO·)、丙烯醛氧化修饰均使核桃蛋白质发生聚集、空间结构无序化程度增加，进而导致其溶解度、乳化性及乳化稳定性降低[26-28]。

4.3 酶法改性

酶法改性通过酶作用使蛋白质发生降解或交联聚合，进而改善蛋白质的功能特性，酶法改性是目前核桃蛋白改性研究的重点。Alcalase 碱性蛋白酶对核桃分离蛋白进行酶解有效提高了核桃蛋白分离物的氮溶解指数，改善了其发泡、泡沫稳定性、乳化、乳化稳定性及吸油性和吸水性等功能特性[29]。采用Trypsin 和 Alcalase对核桃蛋白分离蛋白进行水解时发现，水解产物的溶解度随水解度增加而提高，Trypsin 水解产物的乳化性及乳化稳定性得到显著提高[30]。采用胰蛋白酶水解脱脂核桃蛋白粉，底物与胰蛋白酶的比例为20∶1、pH 8.0、温度55 ℃、水解12 h获得多肽具有良好的羟基自由基清除、氧自由基吸收能力及与谷胱甘肽和脑活素相当的 H2O2诱导PC12 细胞损害的保护功能，同时表现出改善记忆和学习的功能[31]。采用Alcalase和Trypsin对核桃蛋白进行水解，水解所得的肽具有较好的抗氧化及抗高血压活性[32]。采用中性蛋白酶对核桃饼粕进行水解制备核桃饼粕蛋白多肽对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果，且多肽分子质量越小抑菌性越强[33]。

5 核桃蛋白的开发与应用

核桃蛋白在食品领域中的应用还比较有限，其主要被开发成核桃乳、核桃粉、核桃多肽等产品，以及作为特殊功能性成分的食品配料。

核桃乳一般分为用未脱脂的核桃仁加工的全脂核桃乳和去除全部油脂后的核桃蛋白制成的脱脂核桃乳。其中，全脂核桃乳因其含油量较高容易分层，脱脂核桃乳因油脂含量较低则比较稳定。核桃乳生产的主要技术难题是体系不稳定，通常需要添加稳定剂、乳化剂和增稠剂。刘淼等[34]将溶剂法提取油后的核桃浆液经过浸提后溶出大量蛋白质，通过添加复配的乳化剂和稳定剂，获得了较好稳定性的乳液。郝艳宾等[35]以核桃仁为原料，经脱皮、破碎、压榨等工艺提取部分核桃油，再将去除油脂后的核桃仁打浆、调配、均质和杀菌等工艺制成核桃蛋白饮料。通过添加红枣能增加核桃乳的营养价值[36]，以及通过发酵制备核桃酸乳等[37]。

核桃粉分为全脂型和低脂型两种。低脂型核桃粉含油少，因此保质期长；全脂型核桃粉含有较高的油脂，因此保质期短。速溶不完全及保质期短是核桃粉产品的主要技术难题，因此，核桃粉的开发研究以低脂核桃粉为主，采用不同干燥技术对除油后的核桃粕进行加工制备核桃粉产品。利用4号溶剂浸出核桃油制备低温核桃粕，然后通过喷雾干燥制取速溶核桃粉[38]。对4号溶剂浸油后的低温脱脂粕进行超微粉碎，由于粒径小，不仅可作为食品添加，亦可用于制作香味浓郁、极富营养的保健低脂蛋白粉[39]。核桃多肽具有易消化吸收、抗氧化等特性，此外，因其具有良好的溶解性，也可作为高蛋白类流体食品的理想原料与添加剂，是生产功能性食品的原料[18]。

通常采用酶解生产核桃蛋白多肽。不同的酶制剂酶解核桃蛋白制备的核桃多肽在功能性方面有较大差异。姜莉等[18]研究了三种蛋白酶对核桃蛋白质水解的能力，发现胰蛋白酶的水解能力最强，木瓜蛋白酶的水解能力最弱，酶解物核桃多肽在乳化性、起泡性、吸油性等方面都优于核桃蛋白质。李艳伏[40]用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解核桃蛋白制备核桃多肽，具有较好的功能特性和抗氧化能力。

将核桃蛋白作为功能性成分加入其他食品中的研究比较少。国外研究主要集中在肉类加工制品中加入核桃脱脂粉、核桃仁来改善肉制品的感官特性、营养价值等[41,42]，以及改善肉制品如肉糜的理化特性、乳化性和流变特性[43,44]。