高效液相色谱法同时测定蔷薇科木本植物油中的苯甲醇和苯甲醛

朱 琳 张 蕊 郝希成 王松山 王松雪 郭宝元 薛雅琳 张 东 刘鑫辉 郭咪咪

(国家粮食和物资储备局科学研究院1，北京 100037)(吕梁学院2，吕梁 033000)

杏仁油和长柄扁桃油均是具有杏仁风味的蔷薇科木本植物油，其固有的杏仁风味是评价杏仁油和长柄扁桃油品质的重要指标之一，也是消费者选择尝试新油种的重要依据，根据文献报道，这种浓郁的杏仁味主要是由苯甲醇和苯甲醛等多种风味物质协同作用的结果[1-4]。

目前，针对植物油进行风味评价的方法主要有顶空微萃取气相色谱-质谱法、电子鼻和气相色谱法-质谱-嗅闻联用等定性或半定量方法[1-7]，几乎没有风味物质苯甲醇和苯甲醛定量方法的报道。在现有文献报道[8-21]中针对苯甲醇定量方法主要有高效液相色谱法和气相色谱法，涉及的前处理样品主要是食品添加剂纯品、化妆品及药用辅料、药品等；针对苯甲醛定量测定方法主要有分光光度法、电位滴定法、高效液相色谱法、气相色谱法等，涉及前处理样品主要集中在电合成产物、食品添加剂等纯品类；注射液等药品类；蜂蜜、饮料等食品类；燃料烟气、食品接触材料、复杂芳烃体系等环境化工品类，在文献中尚未有以植物油作为前处理样品进行苯甲醇和苯甲醛定量分析的方法。因此，本研究建立了一种前处理简便，适用于植物油中苯甲醛和苯甲醇定量分析的高效液相色谱法。该方法可用于杏仁油和长柄扁桃油等蔷薇科木本植物油风味的评测，有利于生产企业在风味品质控制时运用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

市场采购长柄扁桃油、杏仁油各2个:长柄扁桃油1号、2号，杏仁油1号、2号。

甲醇：色谱纯；磷酸：优级纯；苯甲醇标准品(≥98%)；苯甲醛标准品(≥98%)。

1100型高效液相色谱仪：配可变波长紫外检测器。

1.2 方法

1.2.1 标准储备的溶液配制

苯甲醇储备溶液(1 mg/mL)：称取25.0 mg(精确至0.000 1 g)苯甲醇准品(4.4)于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.1)溶解并定容，保存于-20 ℃；

苯甲醛储备溶液(1 mg/mL)：称取25.0 mg(精确至0.000 1 g)苯甲醛准品(4.5)于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.1)溶解并定容，保存于-20 ℃。

1.2.2 样品前处理

准确称取植物油样品0.200 0～1.000 0 g于10 mL尖底离心管中，加入3 mL甲醇，涡旋30 s后，4 000 r/min离心10 min后，将上清液转移至10 mL棕色容量瓶中，再在样品中加入2 mL甲醇，涡旋30 s后，4 000 r/min离心10 min，将上清液并入之前的提取液中，再加入2 mL甲醇重复提取两次。将上述4次甲醇提取液合并于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，混匀后，将该提取液用微孔滤头过滤至棕色进样瓶中，待上机分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相∶甲醇∶0.02%磷酸水溶液=30∶70，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，可变波长紫外检测器：0～17 min 210 nm检测苯甲醇，17～30 min 250 nm检测苯甲醛。

2 结果与分析

2.1 苯甲醇和苯甲醛最佳检测波长的确认

在195～350 nm下对苯甲醇和苯甲醛标准溶液进行光谱扫描，扫描图谱详见图1。苯甲醇有一个吸收峰，最大吸收波长为206 nm，苯甲醛有两个吸收峰，吸收波长分别为201.3 nm和249.7 nm。

图1 苯甲醇和苯甲醛光谱扫描图

由于甲醇等流动相试剂在小于210 nm会有吸收，因此，将苯甲醇的最佳检测波长设定为210 nm，苯甲醛的最佳检测波长设定为250 nm。

2.2 苯甲醇和苯甲醛高效液相色谱流动相条件的优化

本方法初始流动相和比例选择了甲醇∶水(20∶80)液相条件，在该液相条件下，苯甲醇色谱峰对称性较高，但是，苯甲醛色谱峰会发生前倾(对称因子为1.577)，详见图2，因此，需要对检测苯甲醇和苯甲醛的流动相进行优化。

注：峰1为苯甲醇，峰2为苯甲醛。

色谱峰前倾主要有两种情况[23]，一种是上机液与流动相不一致，另一种是样品超载。可以通过调节流动相的pH改善峰型排除这两个原因，一般可用磷酸或醋酸调节pH。经对比，苯甲醛上机液与流动相一致或不一致，改变其进样量与进样浓度，苯甲醛的峰型均无改善，仍前倾。因此，需要调流动相的pH来改善峰型。苯甲醇的检测波长为210 nm，醋酸在210 nm附近有较强吸收，会影响方法的检出限，而磷酸在紫外区没有吸收，因此，本方法选用磷酸对流动相的pH进行调节。以甲醇与不同浓度磷酸水溶液(20∶80)为流动相，考察不同pH值对苯甲醇和苯甲醛色谱峰型对称性的影响，其对称因子详见表1。

表1 不同浓度磷酸水溶液流动相的出峰情况

根据文献[23]，理想色谱峰的对称因子为0.95～1.1(绝对对称峰的对称因子为1.0)，一般生产厂家对新柱的对称因子要求为0.95～1.3，被测样品对称因子一般要小于1.5。从表1可以看出，甲醇与0.02%～0.05%磷酸水中的对称因子符合该要求，但是根据市售的色谱柱进行查询，一般的色谱柱所能承受的pH范围一般在2.0～8.0。因此，为了使建立的方法具有普适性，本方法选择甲醇与0.02%磷酸水作为分析苯甲醇和苯甲醛的流动相，出峰时间在40 min以内。

由于苯甲醇和苯甲醛的出峰间隔大于10 min，因此，可以调高有机相甲醇的比例，缩短检测时间，提高检测效率，甲醇与0.02%磷酸水流动相比例优化见表2。

表2 甲醇与0.02%磷酸水流动相比例优化

从表2可以看出，甲醇∶0.02%磷酸水为30∶70时，不仅出峰快，而且色谱峰的性噪比更高，灵敏度更好，因此，该比例的流动相更适宜分析苯甲醇和苯甲醛。

按上述色谱条件分析的实际植物油样品，苯甲醇和苯甲醛均可以达到基线分离且峰型对称，见图3。

注：峰1为苯甲醇，峰2为苯甲醛。

2.3 研究建立苯甲醇和苯甲醛的前处理条件

2.3.1 提取方式和提取溶剂的选择

目前，在植物油中苯甲醇和苯甲醛的检测方法几乎没有文献报道，而药用辅料及药品、蜂蜜、饮料等样品中苯甲醇或苯甲醛的前处理方式并不适合植物油样品[8-21]。考虑苯甲醇、苯甲醛属于食品添加剂范畴[23-25]，因此，本研究参照了文献[26，27]中针对油脂含量高样品和植物油样品的前处理方式，采用离心萃取的方式进行前处理。

根据目标物苯甲醇和苯甲醛溶解性、样品基质及提取剂的极性选取合适的萃取溶剂。苯甲醇和苯甲醛微溶于水，易溶于醇、醚、氯仿等有机溶剂，但醚和氯仿可与植物油互溶，因此，针对植物油样品中苯甲醇和苯甲醇的萃取溶剂首选醇类溶剂。醇类溶剂不与植物油互溶，同时，可从植物油中将苯甲醇和苯甲醛萃取出来。常用醇类溶剂主要有甲醇和乙醇，相比于乙醇，甲醇比乙醇的极性强，比乙醇亲脂性弱，溶解脂类干扰物质比乙醇少，因此，在萃取时，本实验选用甲醇作为萃取溶剂。

2.3.2 苯甲醇和苯甲醛提取次数的优化考察

按1.2.2方法考察植物油中苯甲醇和苯甲醛甲醇提取效率，详见图4。仅苯甲醛用2 mL提取第1次的结果略低一些，而苯甲醇和苯甲醛用2 mL提取第2次至第5次的结果几乎呈一条直线，苯甲醇提取第2次至第5次的结果RSD为0.24%，苯甲醛提取第2次至第5次的结果RSD为0.75%，因此，用2 mL提取至第2次，苯甲醇和苯甲醛已接近提取完全，但是为了保证提取率，本方法选取用2 mL提取3次。

图4 植物油样品中苯甲醇、苯甲醛用2 mL甲醇提取次数的优化

2.3.3 苯甲醇和苯甲醛不同提取方式的考察

按1.2.2方法考察植物油中苯甲醇和苯甲醛甲醇提取方式，对比涡旋30 s与超声10 min对提取率的影响，二者结果无明显差异。为了节省提取时间，本方法选用涡旋30 s。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围

在210 nm下，苯甲醇的高效液相色谱法线性范围为0.1～100 μg/mL，标准曲线Y=44.098X+1.557，R2=0.999 6。

在250 nm下，苯甲醛的高效液相色谱法线性范围为0.1～100 μg/mL，标准曲线Y=69.651X+2.362，R2=0.999 9。

2.4.2 检出限和定量限

以S/N≥3确定方法的检出限，S/N≥10确定方法的定量限，在210 nm下苯甲醇的检出限为0.41 mg/kg，定量限为1.23 mg/kg，在250 nm下苯甲醛检出限为0.33 mg/kg，定量限为0.98 mg/kg。

2.4.3 准确性和重复性

选取蔷薇科木本植物油样品长柄扁桃油分别添加三个水平的苯甲醇和苯甲醛，验证苯甲醇和苯甲醛的测定准确性。该植物油本底经5次重复测量，苯甲醇测量结果分别为60.9、61.4、61.9、60.9 mg/kg和61.6 mg/kg，平均结果为61.4 mg/kg，RSD为0.72%，苯甲醛测量结果分别为192.0、193.6、194.7、192.3 mg/kg和194.7 mg/kg，平均结果为193.5 mg/kg，RSD为0.66%，苯甲醇和苯甲醛分别按本底的50%、100%、200%的进行添加，经3次重复测量的平均回收率和相对标准偏差结果见表3～表4。

表3 蔷薇科木本植物油添加三个水平的苯甲醇加标回收率和相对标准偏差结果(n=3)

表4 蔷薇科木本植物油添加三个水平的苯甲醛加标回收率和相对标准偏差结果(n=3)

从表3和表4可以看出，苯甲醇加标平均回收率为91.8%～93.7%，相对标准偏差为0.6%～2.0%，苯甲醛加标平均回率为96.5%～97.7%，相对标准偏差为0.2%～2.9%。

2.4.4 标准品及提取样品的稳定性监测

苯甲醇标准储备液(1 mg/mL)和苯甲醛标准储备液(1 mg/mL)分别储备于4 ℃，-20 ℃冰箱，每次取出恢复到室温后，稀释至20 ug/mL进行10 d的稳定性监测，苯甲醇和苯甲醛监测峰面积见图5。经计算，苯甲醇标准储备液(1 mg/mL)在4 ℃储存10 d，峰面积的RSD为1.7%，在-20 ℃储存10 d，峰面积的RSD为3.5%；苯甲醛标准储备液(1 mg/mL)在4 ℃储存10 d，峰面积的RSD为14.0%，在-20 ℃储存10 d，峰面积的RSD为1.9%。从标准溶液稳定性测试结果来看，4 ℃和-20 ℃储存的苯甲醇标准储备液的RSD均在5%以内，因此，苯甲醇标准溶液在4 ℃和-20 ℃储存均可，而苯甲醛标准溶液储存在4 ℃不太稳定，在-20 ℃较为稳定，综合考虑，以放置-20 ℃中存储为宜。

图5 苯甲醇和苯甲醛标准品稳定性监测

样品提取溶液在0、2、4、8、12、24、48 h分别测定，其苯甲醇和苯甲醛峰面积见图6。经计算，苯甲醇峰面积的RSD为0.4%，苯甲醛峰面积的RSD为1.1%，表明样品提取液在室温条件下48 h内是稳定的。

图6 样品提取液中苯甲醇和苯甲醛稳定性监测

2.5 实际样品测定

采集市售的2个长柄扁桃油和2个杏仁油样品，利用上述液相方法对苯甲醇和苯甲醛进行测定分析，测定结果见图7。所采集的市售长柄扁桃油样品中苯甲醇含量略高于市售杏仁油样品，而市售的杏仁油样品中苯甲醛含量明显高于市售长柄扁桃油样品。

对市售的2个长柄扁桃油和2个杏仁油样品按照文献[28]对植物油进行人工方法的气味检验，结果表明，相较于长柄扁桃油，杏仁油的杏仁风味更为浓郁。由此说明，样品中苯甲醛的含量对蔷薇科木本油脂风味浓郁程度的影响比苯甲醇影响大，其与风味浓郁程度正相关，对木本油脂整体的杏仁风味贡献大，这与孙晶波等[1]的报道GC/MS气质分析的毛樱桃(长柄扁桃的俗称)核壳及核仁挥发油结果是一致的。另外，长柄扁桃油1号样品与长柄扁桃2号样品之间，杏仁油1号样品与杏仁油2号样品之间哪个风味更为浓郁是难以通过文献[28]中的气味检验进行人工辨别的，因此，同一种油种的风味评测需要通过仪器进行定量检测，以判定哪一种生产工艺生产的蔷薇科木本植物油风味更为浓郁。

3 结论

本研究建立一种同时测定蔷薇科木本植物油中苯甲醇和苯甲醛的高效液相色谱方法，该方法苯甲醇加标平均回收率为91.8%～93.7%，相对标准偏差为0.6%～2.0%，苯甲醛加标平均回率为96.5%～97.7%，相对标准偏差为0.2%～2.9%。苯甲醇的检出限为0.41 mg/kg，定量限为1.23 mg/kg，苯甲醛的高效液相色谱检出限为0.33 mg/kg，定量限为0.98 mg/kg，该方法不仅回收率高，重复性好，灵敏度高而且操作简便，方便生产企业进行风味品质控制时运用，无需企业购置气相色谱-质谱等昂贵设备进行风味评测，大大节约监测成本。该方法不仅可指导企业优化工艺，适度保留蔷薇科木本油脂中苯甲醇和苯甲醛等风味物质，满足消费者对木本油脂杏仁口味的需求，同时也为下一步科学评价蔷薇科木本油脂产品风味提供了技术支撑。