不同施肥处理条件下闽楠叶片精油组分GC/MS鉴定分析

董 翔 何功秀 文仕知 刘 丽 何含杰 张党权

(水土保持与荒漠化防治湖南省高校重点实验室；中南林业科技大学林学院1，长沙 410004)(河南农业大学林学院2，郑州 450002)

闽楠[Phoebebournei(Hemsl.)Yang]，俗称楠木，樟科楠属常绿大乔木，是中国特有珍贵用材树种、国家二级濒危保护植物[1]，闽楠和桢楠、紫楠并称为业界传统“金丝楠”的三大载体，是建筑、家具、雕刻和精密木模等的高级用材，也是优良的庭院观赏树种[2]。由于野生资源的掠夺式采伐利用，导致资源日趋衰竭，价值迅速提升，人工林发展较快，由于成材期长[3]，在成材期内对其各部位精油进行开发利用，可以在不影响其生长的同时提高其经济价值。研究人员已从闽楠、桢楠等叶片精油中检测出β-榄香烯、反式石竹烯等大量香料和药用类物质[4]。有研究表明β-榄香烯具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保护心血管、防治肿瘤、改善免疫功能等作用[5]，反式石竹烯可以抑制肿瘤坏死因子诱导的人软骨细胞炎症[6]。闽楠叶片精油产率低、品质良莠不齐成为制约闽楠精油产业发展的问题[7]。

精油是芳香植物花、叶、茎、嫩枝、树皮等部位的次级代谢产物，可通过压榨、蒸馏、萃取等方法获得[8,9]。精油的产率、品质与植物的遗传背景，生长环境和提取工艺等息息相关[10]。通过对几种近缘植物甜荞麦、苦荞麦和金荞麦进行水蒸气蒸馏提取精油，发现苦荞麦精油含量明显较高[11]。采用微波辅助法提取黑藻种子挥发油，精油产率较传统水蒸气蒸馏法高出0.1%[12]，以粉碎-绝氧陈化-紫外线激活的方法，可以提高柑橘香精油中的含氧萜烯类含量的相对含量，提升精油品质[13]，但这些方法仪器设备昂贵、流程复杂、成本较高。有研究人员发现配合施用牛粪和NPK3-12-6并覆盖塑料膜可以大幅提高香叶天竺葵精油的产量[14]，施营养液会影响迷迭香中精油的含量和品质[15]，表明施肥能改善精油产率和品质，且生态环境友好，成本低，易于推广。本研究以湖南金洞林场5年生闽楠为对象，利用水蒸气蒸馏法和GC-MS分析，研究不同施肥处理下闽楠叶片精油的产率和挥发性成分差异，探索施肥提升闽楠叶片精油含量与品质的规律，为其精油的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

叶片采自湖南省永州市金洞区金洞林场5年生闽楠，每个处理设置3块10 m×20 m的样地，每块样地的坡度、坡位均相似，样地间间隔一行树木，每块样地30株树。2018年9月1日人工除草后，将12块样地分为4组，分别进行环施有机肥1 kg/株、复合肥400 g/株、菌肥20 g/株和不施肥处理，施肥浓度选择林场施肥管理常用的浓度。90 d后，采取五点取样法随机采集各样地闽楠的叶片，混合，洗去叶片表面灰尘杂质，自然风干后，打粉备用。室内实验于2018年12月8日—10日在经济林育种与栽培国家林业和草原局重点实验室完成。GC/MS鉴定与分析由湖南省食品质量监督检验研究院完成。

1.2 仪器与试剂

气相色谱-质谱仪GC7890B-MS5975C，智能恒温加热套，超纯水机。

无水乙醇(分析纯)，去离子水，无水硫酸钠(分析纯)，1.5 mL离心管，有机肥(氮磷钾5%，有机质45%)，复合肥(氮15%，磷15%，钾15%)，菌肥(复合芽孢杆菌)。

1.3 精油水蒸气蒸馏法提取

提取方法参照朱丽云等[16]、毛运芝等[17]方法并进行改进，取300 g闽楠叶片样品粉末放入5 L蒸馏瓶中，加入2 400 mL去离子水(料液比1∶8)，采用水蒸气蒸馏装置100 ℃提取7 h,加装冷凝回流装置和收集装置，收集装置中水液面上方一层淡黄色油状物，即为样品精油，提取完毕待管壁冷却后，用移液器将精油移至1.5 mL离心管中，4 ℃密封保存。精油产率计算方法[18]：闽楠精油产率=精油体积/闽楠叶质量×100%，取平均值即为精油产率。

1.4 精油检测方法与条件

前处理：移液器吸取无水乙醇1 mL至1.5 mL离心管中，再吸取20 μL精油伸入乙醇液面下，将精油推入，摇匀，加入适量无水硫酸钠，摇晃半分钟左右，静止3 h，8 000 r/min离心2 min，取700 μL送检。

精油检测：参照丁文等[19]方法对四种施肥处理的闽楠叶片精油进行GC-MS检测，对检测条件进行了改动和优化。

色谱分离条件：色谱柱为Agilent-HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样量1 μL，进样口250 ℃；载气为高纯氦气；柱温箱升温程序则是初始温度50 ℃，以5 ℃/min升到130 ℃，再以2 ℃/min升到155 ℃，8 ℃/min升到180 ℃，10 ℃/min升到250 ℃；分流比20∶1。

质谱检测条件：离子源为EI；电离能70 eV；辅助加热区280 ℃；离子源230 ℃；四级杆150 ℃；采集模式为全扫描，质量扫描范围35～550(m/z)；溶剂延迟3 min。

1.5 数据处理与分析

闽楠叶片精油经GC-MS检测后，采用化合物谱库(NIST17)进行分析，得出各峰的物质和匹配度，统计各峰匹配度大于90%的物质，并参考保留时间确定物质，绘制表格。采用色谱峰面积归一化法，并参照卞京军等[20]方法进行定量分析。数据与统计分析及表格绘制采用Excel 2016完成，离子流量图及柱状图绘制采用Origin 9.0完成。

2 结果与分析

2.1 闽楠叶片精油产率分析

由表1可知，闽楠叶片精油产率分别为有机肥处理0.095 7%，复合肥处理0.085 0%，菌肥处理0.070 9%，不施肥处理0.076 7%。有机肥处理组的闽楠叶片精油产率最高，较不施肥处理组提高24.77%、较复合肥处理组的精油产率提高12.59%。菌肥处理组的精油产率最低，较不施肥处理组低7.56%。四种处理精油均为淡黄色油状，其中复合肥处理组颜色最深，菌肥处理组颜色最浅，表明闽楠叶片精油中某些与颜色相关的成分的相对质量分数以复合肥处理最高，菌肥处理最低。

表1 四种施肥处理闽楠叶片精油产率及性状

2.2 精油挥发性成分组成

经GC-MS分析得到4种施肥处理的闽楠叶片精油总离子色谱图(图1)，共鉴定出83种挥发性成分，相对质量分数大于1%的主要化学成分如表2所示。其中有机肥处理精油中共检测出67种挥发性成分，主要物质有牛儿烯(14.50%)，(+)-喇叭烯(13.35%)，(-)-α-蒎烯(5.72%)，δ-杜松烯(5.58%)，β-桉叶醇(4.66%)等。复合肥处理精油中共检测出72种物质，主要物质有(+)-喇叭烯(15.67%)，牛儿烯(12.82%)，δ-杜松烯(6.96%)，(-)-α-蒎烯(4.19%)，(+)-香橙烯(4.02%)等。菌肥处理精油中共检测出65种挥发性成分，主要物质有牛儿烯(16.51%)，(+)-喇叭烯(12.81%)，δ-杜松烯(9.66%)，(+)-香橙烯(5.41%)，蛇麻烯(3.92%)等。不施肥处理精油中共检测出66种挥发性成分，主要物质有牛儿烯(20.34%)，(+)-喇叭烯(16.28%)，δ-杜松烯(5.02%)，(+)-香橙烯(4.89%)，(-)-α-蒎烯(4.09%)等。

表2 四种施肥处理的闽楠叶片主要精油化学成分及相对质量分数

图1 四种施肥处理闽楠叶片挥发性成分总离子色谱图

2.3 4种施肥处理的闽楠叶片精油典型组分质谱图分析

参考胡文杰等[21]、邱海燕等[22]研究，以相对含量大于5%为标准，确定闽楠叶片精油典型组分。由表2分析可得，四种施肥处理的闽楠叶片精油中相对含量大于5%的典型组分有5种，分别是：牛儿烯，(+)-喇叭烯，(-)-α-蒎烯，δ-杜松烯，(+)-香橙烯，GC-MS分析得到五种物质的质谱图如图2所示。五种物质的分子式均为C15H24，相对分子质量为204，与质谱图中显示的分子离子质荷比为204一致。

图2 闽楠叶片精油典型组分质谱图

2.4 4种施肥处理的闽楠叶片精油品质分析

2.4.1 挥发性成分种类的数量差异

四种施肥处理90 d后的闽楠叶片精油分离出的挥发性成分见图3，共包括烃类47种、醇类17种、醛类8种、萘类6种，酮类3种、酯类1种、呋喃1种。其中，四种处理的叶片精油中相同成分有51种，多数为萜烯烃类和萜醇类化合物，是闽楠精油芳香气息的主要来源，表明施肥处理不会造成闽楠叶片精油成分的种类发生大幅度的变化，但仍有一定的差异。有机肥提高了烃类、醛类、萘类物质的数量，降低了酮类和呋喃类物质的种类；复合肥提高了烃类、醇类、醛类、萘类物质的数量；而菌肥提高了醇类、萘类物质数量，降低了烃类、酮类物质数量。

图3 4种施肥处理的挥发性成分种类的数量

2.4.2 挥发性成分种类的相对质量分数差异

4种施肥处理的挥发性成分种类及其相对质量分数(图4)与不施肥组相比，有机肥和复合肥均可降低闽楠叶片精油中烃类物质的相对质量分数，提高醇类、醛类、萘类、酯类物质的相对质量分数；而菌肥则提高了烃类、醛类、呋喃类物质的相对质量分数，其他类均降低。有机肥处理、复合肥处理、菌肥处理和不施肥处理的含氧化合物的总相对质量分数大小分别为19.58%、19.51%、13.07%、17.52%。而精油品质优劣与含氧化合物含量密切相关，常用于提升精油品质的方法为降低精油中烃类物质含量、提高含氧化合物含量[23]。因此，有机肥与复合肥处理降低了叶片精油中烃类物质含量，提高了含氧化合物的含量；而菌肥处理则提高了烃类物质相对质量分数，降低了含氧化合物总相对质量分数。表明有机肥与复合肥处理可以提高闽楠叶片精油品质，且有机肥处理的精油品质更高，而菌肥处理会降低精油品质。

图4 四种施肥处理的精油挥发性成分种类及相对质量分数

2.4.3 挥发性成分相对质量分数差异

由表2可以看出，与不施肥处理相比，有机肥处理提高了叶片精油中28种物质的相对质量分数，降低了48种物质的相对质量分数；复合肥处理提高了39种物质的相对质量分数，降低了27种物质的相对质量分数；菌肥处理提高了29种物质的相对质量分数，降低了44种物质的相对质量分数。每个处理组相对质量分数最高的六种挥发性成分比较如图5所示。四种施肥处理的叶片精油中，牛儿烯和(+)-喇叭烯的相对质量分数较最高。有机肥处理的闽楠叶片中相对质量分数大于1%的共检测出23种，(-)-α-蒎烯、β-桉叶醇和反式石竹烯比其他处理组高，比不施肥处理组分别高1.63%、1.95%、1.73%(图5a)。复合肥处理的闽楠叶片中相对质量分数大于1%的共检测出23种，(-)-α-古芸烯比其他组高，比不施肥处理高0.71%(图5b)。菌肥处理的闽楠叶片中相对质量分数大于1%的共检测出23种，δ-杜松烯、(+)-香橙烯、蛇麻烯和大牛儿烯D均比其他处理组高(图5c)，比不施肥处理分别高4.64%、0.52%、3.23%、0.54%。不施肥的闽楠叶片中相对质量分数大于1%的共检测出22种，牛儿烯和(+)-喇叭烯的含量均高于其他处理组(图5d)。因此，不同施肥处理可以用来提高或降低精油中某些成分的相对质量分数，可用于定向培育与开发利用。

图5 4种施肥处理的挥发性成分种类及相对质量分数

3 讨论

在提取工艺方面，本研究改进了朱丽云等[16,17]的水蒸气蒸馏提取方法，调整料液比从1:6至1:8，以回流速度每秒2～3滴作为参考标准设定温度[24]，采用5 L容量瓶，加入300 g叶片和2.4 L水进行提取，在冷凝回流管下方增加了一个定制的虹吸式连通器[25]收集装置，解决了提取过程中料液比不适宜及加热套温度过高导致蒸馏瓶壁易出现焦糊状物质的问题，避免了提取过程由于过满，容易向上喷涌的安全隐患问题，提高了精油提取精度，减小了精油损耗，并方便观测和收集。

针对施肥对植物精油含量及品质影响方面研究发现[26-30]，柠檬马鞭草施用生物肥料能显著提高精油含量，莳萝施用生物肥料和化肥可增加精油中香芹酮含量，互叶白千层施用微量元素硼会降低枝叶精油中1,8-桉叶素的含量，桂花施磷肥则会降低精油中的物质种类，而迷迭香精油产量和组分则不受无机肥和有机肥的影响。本研究表明，闽楠施有机肥和复合肥能明显提高叶片精油的产率和品质，而菌肥会降低产率和品质。三种施肥处理的叶片精油中牛儿烯含量均低于不施肥组，表明了牛儿烯作为平台中间体在施肥后被用于合成了其他活性成分，菌肥处理后可能用于合成了烃类物质。因此，通过施肥提高闽楠精油的产率和品质，调控其精油的关键组分产量，对提升闽楠的实际应用价值和经济价值，具有很高的探索和应用价值。

4 结论

有机肥、复合肥、菌肥和不施肥处理90 d的闽楠叶片精油产率分别为0.095 7%、0.085 0%、0.070 9%、0.076 7%。有机肥和复合肥可以提高闽楠叶片精油的产率，而菌肥会降低叶片精油产率。

从四种施肥处理的叶片精油中分别检测出物质67种，72种，65种，66种。精油分离出的挥发性成分共包括烃类47种、醇类17种、醛类8种、萘类6种，酮类3种、酯类1种、呋喃类1种。

四种施肥处理的叶片精油中含氧化合物的总相对含量大小分别为19.58%、19.51%、13.07%、17.52%。有机肥和复合肥可以提高闽楠叶片精油的品质，而菌肥会降低精油品质。

闽楠叶片精油典型组分为牛儿烯，(+)-喇叭烯，(-)-α-蒎烯，δ-杜松烯，(+)-香橙烯。不同施肥处理可以用于改变叶片精油中成分的种类和相对含量，也可以用于提高特定需求成分或降低有害成分的相对含量，对闽楠进行定向培育与开发利用。