微波辅助碱液提取花生壳黄酮工艺

谷政伟 李 丹 樊苏萍 刘智超 厉志伟

(湖南航天天麓新材料检测有限责任公司，长沙 410004)

花生(ArachishypogaeaL.)系豆科落花生属植物[1]，原产于南美洲一带，约在16世纪传入中国。现今，我国的花生种植规模已居世界前列[2]。花生壳作为花生生产的附属物，大部分被用作燃料或直接丢弃，导致浪费及环境污染[3]。花生壳含有黄酮，杨增明等[4]发现我国不同产地的花生壳黄酮含量在0.25%～1.42%之间；且已有科研人员从花生壳浸出液中分离出若干黄酮单体[5,6]。黄酮作为天然活性物质，具有抑菌、消炎、抗氧化和抗肿瘤等多种功能[7-11]，在医药、化妆品、食品和保健品中的应用有较大的潜能。

目前，从花生壳中提取黄酮的技术有溶剂提取、微波辅助、超声波辅助、酶辅助、高压脉冲电场辅助和协同辅助等[3,12]。碱液提取是利用黄酮分子多数含酚羟基，显弱酸性，易溶于碱性水的性质[13]。微波辅助技术省时、节能，具有易控制和提取得率较高等优点[14,15]，被广泛应用于天然产物的提取。目前，关于微波辅助提取花生壳黄酮的文献，所使用的提取溶剂多数是乙醇溶液，使用碱液作提取溶剂的报道鲜见[3]。黄酮的提取是后续分离纯化及活性探究的前提；迄今，关于花生壳黄酮提取工艺的报道，少有对提取物进行纯度检测。本文拟采用氢氧化钠水溶液当提取溶剂，以微波作辅助技术提取花生壳黄酮，用盐酸酸化浸出液，使黄酮沉淀析出，并对黄酮粗品进行纯度测定，以期为花生壳的进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木犀草素标准品(纯度：HPLC≥98%)、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝和盐酸均为分析纯。花生壳取自湖南省长沙市郊区。

1.2 实验仪器

BJ-800A中药粉碎机，PyNN130745微波萃取仪，UV 3010紫外-可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作

按参考文献[16]中的AlCl3法操作。

1.3.2 工艺流程

将花生壳洗净，在50 ℃条件下烘干，粉碎，过60 目筛。称取花生壳粉末，放入提取罐，加入一定体积的氢氧化钠水溶液(pH值分别是10、11、12、13、14、15)。把提取罐放入微波萃取仪，设定提取温度和提取时间参数。待提取完毕，过滤，收集滤液。当滤液冷却后滴加稀盐酸调节pH使黄酮沉淀析出，之后静置24 h。过滤，把得到的固体在50 ℃条件下烘干得到花生壳黄酮粗品。

黄酮提取得率按式(1)计算：

(1)

式中：ρ为黄酮提取得率/%；c为检测液中的黄酮浓度/μg/mL；f为稀释倍数；m为花生壳样品的质量/g；v为定容体积/mL。

黄酮纯度按下式计算：

(2)

式中：w为黄酮纯度/%；c为检测液中的黄酮浓度/μg/mL；f为稀释倍数；m为黄酮粗品的质量/g；v为为定容体积/mL。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取溶剂pH对黄酮提取得率的影响

固定花生壳粉末20.00 g、液料比10∶1 mL/g、提取温度50 ℃、提取时间5 min和酸沉pH 4.0，探讨提取溶剂pH分别为10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0时，对黄酮提取得率的影响。

由图1可知，当提取溶剂pH小于12.0，黄酮提取得率随着提取溶剂pH增大而升高，这是因为大多数黄酮，例如木犀草素、香叶木素和圣草酚，含有酚羟基，显弱酸性，可与氢氧化钠反应生成易溶于水的盐类，从而促进细胞内的黄酮转移至提取溶剂当中。当提取溶剂pH大于12.0，黄酮提取得率随着提取溶剂pH增大而降低，这是因为当提取溶剂pH超过一定值，黄酮母核会遭到破坏，同时易溶于碱性溶液的杂质与黄酮进行竞争[17]，抑制细胞内的黄酮溶入提取溶剂当中。因此在后续的单因素实验中，将提取溶剂pH定为12.0。

图1 各因素对花生壳黄酮提取得率的影响

2.1.2 液料比对黄酮提取得率的影响

固定花生壳粉末20.00 g、提取溶剂pH 12.0、提取温度50 ℃、提取时间5 min和酸沉pH 4.0，探讨液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g时，对黄酮提取得率的影响。

由图1可知，当液料比小于25∶1 mL/g，黄酮提取得率随着液料比增大而升高，这是因为当提取溶剂的体积增加，花生壳粉末在提取溶剂中的分散程度亦增大；同时提取溶剂与细胞内中的黄酮浓度差增大。当液料比大于25∶1 mL/g，黄酮提取得率增加不明显，这是因为液料比已不是影响黄酮提取得率的主要因素，继续增大液料比会加大能耗也会导致溶出更多的杂质[18]，因此在后续的单因素实验中，将液料比定为25∶1 mL/g。

2.1.3 提取温度对黄酮提取得率的影响

固定花生壳粉末20.00 g、提取溶剂pH 12.0、液料比25∶1 mL/g、提取时间5 min和酸沉pH 4.0，探讨提取温度分别为40、50、60、70、80、90 ℃时，对黄酮提取得率的影响。

由图1可知，当提取温度小于70 ℃，黄酮提取得率随着提取温度升高而增大，这是因为当提取温度上升，分子热运动速率加大[19]，使细胞壁结构遭受破坏的程度增加，同时提取溶剂溶解黄酮的能力增强。当提取温度大于70 ℃，黄酮提取得率随着提取温度升高而变化不明显，继续升高提取温度，可能会损坏黄酮的生物活性，因此在后续的单因素实验中，将提取温度定为70 ℃。

2.1.4 酸沉pH对黄酮提取得率的影响

固定花生壳粉末20.00 g、提取溶剂pH 12.0、液料比25∶1 mL/g、提取温度70 ℃和提取时间5 min，探讨酸沉pH分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0时，对黄酮提取得率的影响。

由图1可知，当酸沉pH小于3.5，黄酮提取得率随着酸沉pH增大而增大，这是因为黄酮母核中吡喃环上的氧原子具有一定碱性，易形成佯盐而溶解在浸出液中，使部分黄酮没有沉淀析出。当酸沉pH大于3.5，黄酮提取得率随着酸沉pH增大而降低。这是因为多数黄酮分子中具有酚羟基，显弱酸性，当酸沉pH越小，黄酮越容易形成沉淀从浸出液中沉淀析出。因此在后续的单因素实验中，将酸沉pH定为3.5。

2.1.5 提取时间对黄酮提取得率的影响

固定花生壳粉末20.00 g、提取溶剂pH12.0、液料比25∶1 mL/g、提取温度70 ℃和酸沉pH 3.5，探讨提取时间分别为5、8、11、14、17、20 min时，对黄酮提取得率的影响。

由图1可知，当提取时间小于17 min，黄酮提取得率随着提取时间延长而升高，这是因为当提取时间延长，从细胞内扩散至提取溶剂的黄酮逐渐增多，当提取时间大于17 min，黄酮提取得率增加不明显，这可能是因为两相中的黄酮浓度已接近平衡。继续延长提取时间可能会使黄酮发生降解或顺反异构化[15]。

2.2 正交实验结果与分析

2.2.1 正交实验设计与结果

在单因素实验的基础上，以黄酮提取得率为评价指标，利用正交设计助手ⅡV3.1对提取溶剂pH、液料比、提取温度、酸沉pH和提取时间这5个参数进行优化。实验因素及水平如表1所示，实验结果如表2所示。

表1 正交实验因素及水平表

表2 正交实验结果

由表2中的极差R值可知，对花生壳黄酮提取得率的影响大小依次为：提取温度>提取溶剂pH>酸沉pH>提取时间>液料比。

2.2.2 方差分析与验证实验

对表2中的数据进行方差分析，得到的结果如表3所示。

表3 方差分析表

由表3可知，提取溶剂pH、液料比、酸沉pH和提取时间这4个因素均不显著，提取温度这个因素显著。

由表2中的均值1、均值2、均值3和均值4可知，提取工艺的最佳条件是：A2B4C4D4E3，即提取溶剂pH 12.0、液料比30∶1 mL/g、提取温度80 ℃、酸沉pH 4.0、提取时间17 min。因表2中的16组实验没有A2B4C4D4E3这个组合，所以应进行验证实验：取花生壳原料20.00 g，在A2B4C4D4E3条件下，进行8组平行实验，发现黄酮提取得率(1.113±0.010)%，黄酮纯度(16.90±0.13)%。这表明，优化后的微波辅助碱液提取花生壳黄酮工艺稳定、可靠。

3 结论

花生壳廉价易得，以花生壳为原料提取黄酮，节省资金且环保。利用微波作辅助技术，与传统的直接加热技术和酶辅助相比，具有提取时间短等优点[3]；与超声波辅助相比，具有噪声小等优点[3,20]；与高压脉冲电场辅助相比，设备成本低[15]；与协同辅助相比，操作简单[3]。采用氢氧化钠水溶液当提取溶剂，方便使用酸沉技术，将花生壳黄酮从浸出液中沉淀析出。酸沉这一步骤可减轻后续分离纯化的负担，且在酸沉之后过滤得到的滤液，经过调pH等步骤，可当作花生壳黄酮的提取溶剂，从而实现试剂的循环利用；若以乙醇水溶液为提取溶剂，在乙醇回收过程中需旋转蒸发，从而增加功耗和成本。

本研究以湖南省长沙市近郊的花生壳为原料，结合微波辅助技术和碱提酸沉技术开展黄酮提取工艺，利用单因素和正交实验优化工艺参数。发现最优提取条件：提取溶剂pH 12.0、液料比30∶1 mL/g、提取温度80 ℃、酸沉pH 4.0、提取时间17 min。在此条件下，黄酮提取得率(1.113±0.010)%，黄酮纯度(16.90±0.13)%。