稻谷霉菌的分离鉴定及其对稻谷品质的影响研究

李 娜 周红丽 张 兵 周 涛 任剑豪 宗 平 吴卫国

(湖南农业大学食品科学技术学院1，长沙 410128)(中南粮油食品科学研究院有限公司2，长沙 410008)

稻谷是我国主要的粮食作物之一，全国各地都有稻谷的种植产区，年总产量逾2亿t[1]。稻谷的储藏期一般为3年。储藏过程中，微生物在适宜的环境条件下滋生，容易引起储藏稻谷发霉、腐烂和变色，直接或间接地影响储藏稻谷的质量[2]。尤其是在高水分稻谷中，霉菌生长快速，导致稻谷迅速劣变[3]，一些不明显的霉菌毒素危害甚至可影响动物生殖系统[4-6]。

稻谷在储藏过程中，其品质主要受到温度和水分的影响，储粮温度越高、水分含量越高，稻谷霉菌量越大，而水分含量又是真菌生长的决定性因素，当水分含量在霉菌生长临界水分以下，即使温度适宜，霉菌也不会生长[7]。何荣等[8]研究发现，黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(Aspergillusflavus)以及产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)最易导致稻谷结块，此外结块稻谷的出糙率、整精米粒率较低，并且不完善粒率明显增加。储藏期间，储粮上带有的霉菌种类较多，主要是曲霉属和青霉属[9]，有研究发现稻谷中主要优势霉菌为黄曲霉、灰绿曲霉、白曲霉和黑曲霉，其中黄曲霉、黑曲霉大多分布于粮仓上层，白曲霉在下层分布较多，灰绿曲霉则普遍分布于粮仓各层各方位[7]。现阶段仍旧主要依据霉菌的菌落情况和显微结构特征[10,11]，参考菌落、菌丝和孢子的形态观察对霉菌进行鉴定[12]。在此研究背景下，通过对主要霉菌纯化培养，利用分子生物学方法对优势菌种进行鉴定，并研究了霉菌对稻谷品质的影响，为稻谷安全储藏与防控提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

早籼稻：湖南省常德市金牛粮仓7P5仓，入库年份为2018年。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、无水乙醇(分析纯)、氢氧化钾标准滴定溶液(0.500 0 mol/L)、酚酞指示剂、氯化钠(分析纯)、美兰染色液、TSINGKE DNA凝胶回收试剂盒(Code No.GE0101)、rTaq酶(Taq DNA聚合酶)、PCR Mix、测序试剂ABI-bigdye。

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-1D超净工作台，MJ-150-11霉菌培养箱，LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌器，JLGJ45检测砻谷机，JFSD-100-Ⅱ电动粉碎机，202电热恒温干燥箱，HY-4调速多用振荡器，3730XL测序仪(ABI,Foster,CA,USA)，SMA4000微量分光光度计，DYY-6C电泳仪，PCR反应扩增仪，FR980凝胶成像分析系统。

1.3 实验方法

1.3.1 稻谷样品采集

2019年9月6日进行第一次取样，此后每两个月取样一次，共取样3次。采用五点三层取样，分别以距粮堆表面2.4、3.6、4.8 m为上层、中层、下层。以距粮仓东南角、东北角、西南角、西北角1.5 m处及粮仓中央点作为取样点，每一个点位取上、中、下三层的稻谷，共取15份样品，每份样品取1 kg，用无菌取样袋密封取回，于实验室中低温避光保存。对每一层的取样点、及整个粮仓的取样点所取样品，各称取100 g于无菌均质袋中，分别用于每一层的混样和粮仓总混样的检测[13]，取样点位如图1所示。

图1 稻谷取样点位图

1.3.2 霉菌菌种鉴定

1.3.2.1 霉菌菌种初步鉴定

将霉菌接种在PDA培养基中，放置在28 ℃恒温培养箱中培养5 d，并用划线法对霉菌进行分离纯化，得到的霉菌，根据菌落的培养特性和显微特征对菌种进行初步鉴定；霉菌培养特性的观察：根据霉菌的生长速度、培养时间，以及其菌落颜色、气味、形态等，对其进行初步判断。

霉菌显微特征鉴定：挑取菌落边缘的气生菌丝，制片。将其置入显微镜下，观察其是有性或是无性繁殖、营养菌丝的情况以及形态和大小，着重观察其菌丝形态及其分生孢子头的形态，根据霉菌的显微特征对其进行初步鉴定[10]。

1.3.2.2 霉菌菌种鉴定

模板处理：挑取菌体变性处理后，离心取上清为模板，选择相应引物扩增测序验证。

PCR扩增回收：利用引物ITS1/ITS4进行PCR 扩增，引物序列：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 扩增体系与程序见表1和表2。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

使用TSINGKE DNA凝胶回收试剂盒(Code No.GE0101)切胶回收目的片段以相应引物测序。测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对，从中选取同源性高的菌株，再使用MEGA7.0软件，构建系统进化树。

1.3.3 稻谷品质检测指标及其测定方法

霉菌量测定参照GB 4789.15—2016[14]；稻谷出糙率的测定参照GB/T 5495—2008《粮油检验 稻谷出糙率检验》[15]；脂肪酸值的测定参照GB/T 20569—2006《稻谷储存品质判定规则》[16]；整精米率检验参照GB/T 21719—2008《稻谷整精米率检验法》[17]。

2 结果与分析

2.1 稻谷中霉菌的鉴定

2.1.1 霉菌的筛选

对湖南常德储粮粮仓中的稻谷进行定点定时取样，经过三次取样对比，选取了菌落状态、颜色等不同的13种霉菌，暂标记为A、B、C、D、F、I、J、K、L、M、O、P、Q，通过菌株分离及5次纯化得到13种霉菌的纯培养物，并于4 ℃环境保存。

2.1.2 霉菌的形态特征分析及菌种鉴定

经过霉菌形态学对比和测序见表3、表4，可知A、B、C、D、F、I、J、K、L、M、O、P、Q菌株所对应的霉菌分别为：RhizopodiformisisolateHX-1、AspergillusoryzaeisolateNL5、LichtheimiaramosastrainAUMC7961、AspergillusnigerisolateSZ8M-14、AspergillusfumigatusstrainJXL-108Y-1、AspergillusflavusisolateL-4932013、RhizomucorpusillusstrainCNM-CM5124、AspergilluscandidusstrainHDN15-152、PenicilliumcitrinumstrainNSF4、Aspergilluscristatus、PenicilliumislandicumculturecollectionMUCL14074、Aspergilluscristatusstrain33YH-WZ-18、RhizomucorpusillusstrainAUMC7966。

表3 霉菌的形态特征分析

表4 霉菌菌种鉴定

霉菌DNA提取及扩增结果见图2。

图2 琼脂糖凝胶电泳

采用真菌通用引物分别对13种霉菌菌株高度保守序列区域进行PCR扩增，由图2可看出，DNA条带清晰、单一，说明分离纯化得到的是纯培养物，不存在同源区结合位点，提取的DNA纯度较高，最终DNA经PCR扩增后纯度很高。在NCBI上对比后选择同源性较高的菌株并构建系统进化树[28]。

2.2 霉菌对稻谷品质的影响

2.2.1 不同层位稻谷霉菌及其品质的变化

由图3～图7可知，同一粮仓不同取样粮层间稻谷的水分含量、霉菌量、出糙率、整精米率、及脂肪酸值均存在显著性差异(P<0.05)。含水量、霉菌量、脂肪酸值随着储存时间的延长，逐渐上升，均呈上层>中层>下层的趋势，出糙率及整精米率则为下层>中层>上层，随着储存时间的延长，逐渐下降。对比各粮层霉菌的变化量，可推测稻谷含水量增加，有利于稻谷霉菌的生长。

注：不同字母表示同一粮仓稻谷不同层位间差异显著(P<0.05)。余同。

图4 稻谷不同层位霉菌量变化规律

图5 稻谷不同层位出糙率变化规律

图6 稻谷不同层位整精米率变化规律

图7 稻谷不同层位脂肪酸值变化规律

2.2.2 不同点位稻谷霉菌及其品质的变化

由图8～图12可知，同一粮仓不同取样点位间稻谷的含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、及脂肪酸值均存在显著性差异(P<0.05)。由图8可知，粮仓4号和5号点位稻谷水分含量较高，且由图9可知，稻谷的霉菌量随着储存时间的延长是不断上升的，其中4号和5号点位稻谷霉菌量最多，也说明了稻谷水分含量对稻谷霉菌量的积极影响。另每个点位数据均为将该点位三层稻谷的混合样检测所得。稻谷品质的指标检测结果如图10～图12所示，随着时间的延长，粮仓5个点位的出糙率和整精米率均存在下降的趋势，与霉菌量的变化趋势相反，该结果表明稻谷在储藏过程中品质发生了一定的劣变，而霉菌的增长则可能是导致稻谷品质下降的主要因素；粮仓5个取样点位稻谷的脂肪酸值出现了逐渐上升的趋势，变化趋势与霉菌量的变化相同，其中4号、5号点位稻谷脂肪酸值上升幅度较大，对比其霉菌变化量，可推测，霉菌量的变化对脂肪酸值的影响较大，且脂肪酸值越高，稻谷品质则越低[8]。

图8 稻谷不同点位含水量变化规律

图9 稻谷不同点位霉菌量变化规律

图10 稻谷不同点位出糙率变化规律

图11 稻谷不同点位整精米率变化规律

注：不同字母表示同一粮仓稻谷不同点位间差异显著(P<0.05)。

2.2.3 稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、脂肪酸值的相关性分析

采用相关性分析法对稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率及脂肪酸值进行分析，结果见表5。

表5 稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、脂肪酸值的相关性

由表5可知，第一次取样稻谷，含水量与霉菌量、脂肪酸值，出糙率与整精米率均呈极显著正相关(P<0.01)。水分含量、霉菌量与整精米率均呈显著负相关(P<0.05)。霉菌量与脂肪酸值呈显著正相关(P<0.05)；第二次取样稻谷，含水量与霉菌量，出糙率与整精米率均呈显著正相关(P<0.05)。含水量、霉菌量与整精米率均呈极显著负相关(P<0.01)。霉菌量与出糙率呈极显著负相关(P<0.01)；第三次取样稻谷，含水量与霉菌量、脂肪酸值均呈显著正相关(P<0.05)。霉菌量与整精米率呈极显著负相关(P<0.01)，与脂肪酸值呈极显著正相关(P<0.01)。

结果表明稻谷出糙率、整精米率、脂肪酸值均受霉菌量与水分含量的影响，而稻谷水分含量对霉菌量也有一定的影响。稻谷整精米率及出出糙率高，表明其品质相对较好,原因在于出糙率表示的是稻谷中可食用部分占稻谷籽粒总质量的比例，整精米率表示稻谷能够加工出整粒大米产品占稻谷籽粒总质量的比例,我国现行GB 1350—2009《稻谷》和GB/T 17891—1999《优质稻谷》中，出糙率、整精米率均是品质指标[29]。而脂肪酸值则相反，稻谷的脂肪酸值表示其所含游离脂肪酸的多少，随着稻谷储存年限增长，脂肪酸值呈上升趋势，而稻谷新鲜程度与其游离脂肪酸的含量存在一定的关系[30]。稻谷脂肪酸值会随着稻谷中霉菌量的增加而增加，稻谷出糙率与整精米率则会随霉菌量的增加而降低，说明稻谷霉菌对其品质的劣变具有积极作用。

3 结论

通过对分离纯化得到的13种霉菌的形态特征分析及分子生物学鉴定，初步判定13种不同霉菌分别为：A:RhizopodiformisisolateHX-1、B:AspergillusoryzaeisolateNL5、C:LichtheimiaramosastrainAUMC7961、D:AspergillusnigerisolateSZ8M-14、F:AspergillusfumigatusstrainJXL-108Y-1、I:AspergillusflavusisolateL-4932013、J:RhizomucorpusillusstrainCNM-CM5124、K:AspergilluscandidusstrainHDN15-152、L:PenicilliumcitrinumstrainNSF4、M:Aspergilluscristatus、O:PenicilliumislandicumculturecollectionMUCL14074、P:Aspergilluscristatusstrain33YH-WZ-18、Q:RhizomucorpusillusstrainAUMC7966。其中B:AspergillusoryzaeisolateNL5与I:AspergillusflavusisolateL-4932013的菌落颜色、形态较为相似，肉眼观察时，可根据菌落背面颜色区分，B:AspergillusoryzaeisolateNL5的菌落背面颜色为深黄色，I:Aspergillus flavus isolate L-4932013则为白色或米黄色。

实验发现随着稻谷霉菌的增长，稻谷的出糙率和整精米率均下降，与第一次取样相比，最后一次取样的5个点位稻谷出糙率分别下降了0.71%、1.69%、2.51%、2.94%、1.80%，整精米率分别下降了0.49%、6.13%、8.72%、7.56%、8.68%，脂肪酸值分别增加了7.44%、14.10%、0.13%、25.31%、22.19%；采用相关性分析法对不同粮仓稻谷的水分含量、霉菌量、出糙率、整精米率及脂肪酸值进行分析，发现稻谷含水量、霉菌量与整精米率、出糙率均呈显著负相关(P<0.05)，与脂肪酸值呈极显著(P<0.01)和显著正相关(P<0.05)，进一步说明稻谷水分含量和霉菌量对稻谷品质的劣变具有一定的积极作用。