糜子麸皮中多酚提取工艺优化及其抗氧化活性

颜飞翔 朱 丹 苗欣月 牛广财 魏文毅 朱立斌

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319)(黑龙江省农产品加工工程技术研究中心2，大庆 163319)(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院3，大庆 163319)

糜子(PanicummiliaceumL.)又叫稷、黍和糜，属禾本科黍属，株高30-100 cm，生长期短，喜温，耐旱[1]。在我国东北、西北和华北等地均有栽培。糜子的营养价值很高，有“五谷之王”的美誉。糜子果实为颖果，磨米去除皮壳后称黄米，而糜子麸皮作为糜子加工的副产品，约占糜子质量的20%，但其开发利用程度低，除部分用作酿醋原料或饲料外，大部分被废弃[2]。糜子麸皮中含有丰富的多酚类物质。植物多酚是由植物次生代谢产生的一类酚羟基化合物，在豆类、蔬菜、水果和谷类植物的叶、皮、根和果实中广泛存在，被喻为“第七大营养物质”[3,4]。研究表明，植物多酚除了抗氧化作用之外，其本身多样的结构也使其具有其他的生物活性，如防治老年痴呆[5，6]、抗炎[7]、抑菌[8]、抗肿瘤[9，10]、调节肠道菌群[11]及心血管疾病[12]等功效，且已被广泛应用于药品及保健品等领域[13]。

目前，提取植物多酚的方法有很多种，例如溶剂浸提法、超声辅助提取、酶解提取法、微波辅助提取、超临界CO2萃取法等等[14-16]。其中，关于糜子皮壳中提取多酚已有一些报道。杨联芝等[17]采用冰浴均质辅助提取糜子壳中多酚的最佳工艺条件为：丙酮浓度90%，料液比1∶30，提取5次，多酚得率为1.458%；牛伟等[18]研究了糜子皮多酚的水酶法提取工艺，当乙醇溶液pH 4.15，固液比1∶42.5，加酶量1.00%，酶解时间4 h，提取3次时，糜子麸皮酚酸提取率可达1.94 mg/g；王振等[2]通过超声辅助法提取糜子皮中多酚，得到的最佳条件为：40%乙醇为提取剂，料液比1∶25，超声功率320 W，在室温下提取40 min，糜子皮中多酚的平均提取率为9.9mg/g；臧盛等[19]则采用冰浴乳化法和碱化消化后有机溶剂萃取法，对15种糜子壳粉中多酚类物质的含量、组成及抗氧化活性进行研究。结果表明，在15个糜子样品中壳粉中多酚含量为9.357 3～19.092 9 mg/g，主要以结合酚的形式存在，糜子壳粉中不同存在形式的多酚物质均具有抗氧化活性。

超声波-微波协同萃取作为一种新技术，解决了单独超声波和微波提取的不足，超声波产生的振荡能弥补微波传热不均的缺陷，而微波的热能有效地弥补超声波产热不足的问题[20]。目前，鲜有超声波-微波协同萃取方法在糜子麸皮多酚提取中的应用。因此，本研究采取超声波-微波协同萃取方法，以多酚提取量为考察指标，在单因素实验的基础上，通过响应面分析法进一步优化工艺条件，并测定其抗氧化活性，以期为糜子皮壳资源高附加值产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糜子麸皮，黑龙江省肇源县产龙黍23品种，砻米后的副产物；福林酚试剂、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)；无水乙醇、无水碳酸钠、维生素C等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GY-FS-02多功能高速粉碎机，XH-300A型电脑微波超声波合成/萃取仪，L420台式低速离心机，UV-1100紫外可见分光光度计，RE 3000 A旋转蒸发仪，SHZ-D(Ⅲ)真空泵。

1.3 方法

1.3.1 单因素实验设计

考察液料比、乙醇体积分数、提取温度、超声波功率、提取时间、微波功率各自对糜子麸皮多酚提取量的影响[21]。选取液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1[16,21]，乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%[22]，提取温度45、55、65、75、85 ℃[22]，超声波功率400、600、800、1 000、1 200 W[21,23]，提取时间5、10、15、20、25 min[24]，微波功率200、400、600、800、1 000 W[21,23]，进行单因素实验。通过计算糜子麸皮多酚提取量，确定响应面分析实验的因素水平范围，优化工艺条件。

1.3.2 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选取选取液料比、乙醇体积分数、提取温度和超声波功率4个因素为自变量，以多酚提取量为响应值，采用四因素三水平的响应面分析方法，因素与水平编码见表1。

表1 响应面实验因素与水平表

1.3.3 标准曲线的制作

称取25 mg没食子酸用蒸馏水溶解，定容至25 mL，得质量浓度为1 mg/mL没食子酸标准液，分别准确吸取标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用蒸馏水定容至5 mL，得到浓度梯度为0、80、160、240、320、400 μg/mL的标准溶液。准确吸取250 μL各标准液于试管中，再加入1 mL蒸馏水和250 μL福林酚试剂，摇匀，反应6 min后加入2.5 mL 7% Na2CO3，再加入2 mL蒸馏水，室温下避光放置1.5 h后，测定765 nm处的吸光值。以没食子酸浓度为横纵标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。线性回归后得到没食子酸浓度与吸光值的方程为：y=0.003 8x+0.074 5，R2=0.994 7。

1.3.4 糜子麸皮中多酚含量的测定

吸取250 μL提取液于试管中，再加入1 mL蒸馏水和250 μL福林酚试剂，摇匀，反应6 min后加入2.5 mL 7% Na2CO3，再加入2 mL蒸馏水，室温下避光放置1.5 h后，测定765 nm处的吸光值。通过标准曲线方程计算出提取液中多酚的质量浓度，并依照式(1)计算糜子麸皮中多酚提取量，以每克糜子麸皮粉中的没食子酸质量(毫克)表示。

(1)

式中：C为多酚浓度/mg/mL；V为提取液体积/mL；N为稀释倍数；M为样品质量/g。

1.3.5 糜子麸皮多酚体外抗氧化活性测定1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定

取2 mL样品多酚提取液，分别加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液 2 mL，温室避光反应30 min，于517 nm处测定反应溶液的吸光度值[25]。按式(2)计算清除率，其中：A0为样品溶液用等体积的无水乙醇代替测定的吸光度值；Ai为样品溶液的吸光度值；Aj为DPPH溶液用等体积的无水乙醇代替测定吸光度值。

(2)

1.3.5.2 羟自由基清除率的测定

分别取不同浓度样品，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，摇匀静置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸溶液，摇匀，37 ℃恒温水浴1 h，在510 nm下测定吸光度值A1，以蒸馏水为参比溶液，测定吸光度值A0，以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液，测定吸光度值A2[26]。按式(3)计算羟自由基清除率。

(3)

1.3.5.3 超氧自由基清除率的测定

取4.5 mL Tris-HCl(pH 8.2)缓冲液于试管中，在20 ℃水浴预热20 min后，分别加入不同浓度的多酚样品溶液0.1 mL和25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，摇匀后用蒸馏水补充至10 mL。置于25 ℃水浴反应5 min，取出后立即加入1 mL 8 mol/L HCl，于325 nm处的吸光度Ai。空白以蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度A0；考虑到样品液本底的影响，同时测定不加邻苯三酚溶液的相同浓度的样品溶液的吸光度Aj[27]。按式(4)计算超氧自由基清除率。

(4)

1.3.5.4 还原力的测定

取30 μL不同浓度的样品，加入0.2 mol/mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2.5 mL和1%铁氰化钾2.5 mL，混合均匀，于50 ℃恒温水浴中反应30 min后急速冷却，取出再加入10%三氯乙酸2.5 mL。然后取2.5 mL上清液，加蒸馏水2.5 mL，加0.1%三氯化铁0.5 mL，混匀。以蒸馏水为参比溶液于700 nm处测定吸光值[28]。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 糜子麸皮中多酚提取的单因素实验结果

由图1a可知，随着液料比的增大，糜子麸皮多酚的提取量逐渐升高，当液料比增大到40∶1时，提取量最大。浓度差是浸出成分在扩散阶段的主要推动力，随着提取溶剂用量的增加，提高了浓度差，加强了传质推动力，从而增加了糜子麸皮中多酚的提取量[29]。继续增加溶剂用量，糜子麸皮多酚提取量稍有增加，但是增加量不大，考虑到溶剂成本以及后续蒸发浓缩的便利，液料比以40∶1左右为宜。

图1 单因素实验结果

随着乙醇体积分数的增大，糜子麸皮多酚提取量逐渐增大，可能是因为在乙醇体积分数较低时，乙醇可以破坏细胞壁进入细胞内部将酚类物质溶出，当乙醇体积分数达到60%时，糜子麸皮多酚提取量达到最大；但当乙醇体积分数继升高时，提取量反而下降，主要是因为乙醇会引起蛋白质变性在细胞壁形成致密结构而阻碍酚类物质的溶出[30]。因此，乙醇体积分数以60%为宜。

糜子麸皮多酚的提取量随浸提温度的升高而逐渐升高。温度升高时，分子运动加快，氢键更容易断裂，有利于多酚类物质的渗透和扩散。在85 ℃时提取量达到最大值。但是，此时已经高于乙醇沸点，会导致溶剂挥发，并且温度越高，会越加大多酚氧化的可能性。因此，选择适宜的温度为75 ℃。

由图1b可知，糜子麸皮多酚提取量随着超声波的功率的增大呈现先上升后下降的趋势。超声波功率越大，其空化作用和机械作用就越强，细胞组织被分解的更加彻底，粒子运动不断加快，从而有助于多酚物质的溶出，在功率为1 000 W时提取量最高，而后提取量则下降。这可能与大功率的辐射使部分多酚类物质受到破坏，发生降解有关。因此，超声波功率以1 000 W为宜。

当提取时间为10 min 时，糜子麸皮多酚提取量达到最大；当提取时间再延长时，提取量则有所下降，这可能是由于过长时间的超声波-微波的协同作用会破坏多酚结构，同时伴随多酚的部分氧化，从而使提取量降低。因此，适宜的提取时间为10 min。

不同微波功率对糜子麸皮多酚提取量影响较小。微波功率越大，越有助于物料内部升温。分子之间剧烈碰撞产生的大量摩擦热导致局部压力变大，迫使细胞破裂，从而有利于内容物的释放。当微波功率为200 W时，得到了较高的多酚提取量。在200 W之后，糜子麸皮多酚的提取量减少，这可能是由于微波功率上升产生的局部过热破坏了部分多酚的结构，致使多酚的提取量下降[31]。从本实验结果来看，选择微波功率200 W为宜。

微波功率对于糜子麸皮多酚的提取量的影响较小，考虑到能源消耗和经济成本，不再对其进一步优化。而对于因素提取时间来说，在10 min时已经达到较高的提取量，之后随着时间延长一直呈下降趋势。因此，也不再对其进一步优化。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面实验结果

以糜子麸皮多酚提取量为响应值，以A液料比、B乙醇体积分数、C提取温度、D超声波功率进行四因素三水平中心组合实验，结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果

2.2.2 响应面回归方程的建立及方差分析

用Design-Expert 8.0.6数据处理软件对响应面实验结果进行分析，得到二次回归模型方程为：

Y=7.51+0.57A+0.033B+0.45C+0.059D+0.042AB+0.17AC+0.22AD+0.060BC-0.027BD+0.15CD-0.13A2-0.43B2+0.26C2-0.21D2

对模型方程进行方差分析，分析结果见表3。

表3 回归方差分析表

由表3可以看出，F模型=18.91，P模型<0.01，说明上述建立的模型显著；F失拟项=2.65，P失拟项=0.180 6>0.05，失拟项不显著，说明可以用本实验的二次回归方程对响应值进行预测。决定系数R2=0.949 8，说明理论值与实际值拟合良好。通过比较F值的大小可知，各因素对糜子麸皮多酚提取量的影响大小分别为：液料比(A)>提取温度(C)>超声波功率(D)>乙醇体积分数(B)。各因素的二次项中，除了因素A2项外，其余因素的二次项对糜子麸皮多酚的提取量均有显著影响。交互项中，AD的P<0.05差异显著，说明液料比与超声波功率之间的交互作用显著。

2.2.3 验证性实验

响应面实验预测的最佳提取条件为：在液料比50∶1，乙醇体积分数61.28%，温度75 ℃，超声波功率1 000 W。考虑到实际操作，将结果调整为：液料比50∶1，乙醇体积分数60%，提取温度75 ℃，超声波功率1 000 W，微波功率为200 W，提取时间10 min。在此条件下，多酚提取量理论预测值为9.06 mg/g。通过实验证实，提取量为8.92 mg/g，与理论值一致。实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地预测糜子麸皮中多酚提取量。

2.3 糜子麸皮多酚抗氧化活性分析

由图2可知，在质量浓度为0.4～2.0 mg/mL的浓度范围内，糜子麸皮多酚对DPPH自由基清除率随着质量浓度的增加而逐渐增加，当样品质量浓度为2.0 mg/mL时，对DPPH自由基清除率可达92.41%，略低于1 mg/mL的VC清除率(95.40%)。经计算，糜子麸皮多酚的清除DPPH自由基的IC50值为0.006 mg/mL。

图2 糜子麸皮多酚抗氧化结果

当质量浓度小于0.7 mg/mL时，该多酚对于羟自由基的清除率增加缓慢，当质量浓度大于0.7mg/mL时，该多酚对羟自由基的清除率达到了最大值，为69.22%。但是，该多酚对羟自由基的清除率要低于1 mg/mL的VC清除率(92.97%)。经计算，糜子麸皮多酚清除羟自由基的IC50值为0.142 mg/mL。

不同质量浓度的糜子麸皮多酚对超氧自由基的清除能力较低，在质量浓度为0.1～0.9 mg/mL的浓度范围内，该多酚对超氧自由基清除率随着质量浓度的增加而增加，当达到0.9 mg/mL时，清除率为24.41%，远低于1 mg/mL的VC清除率(94.46%)。经计算，糜子麸皮多酚的清除超氧自由基的IC50值为12.048 mg/mL。

在质量浓度为0.1～0.9 mg/mL的浓度范围内，糜子麸皮多酚的还原力随着样品浓度的增加而增加，与浓度有较好的线性关系。当达到0.9 mg/mL时，OD700为0.689，低于1 mg/mL的Vc吸光值1.422。经计算，糜子麸皮多酚的还原力IC50值为4.022 mg/mL。

糜子麸皮多酚含量与DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧自由基清除率和还原力的相关系数r与p值如表4所示。由表4可知，除羟自由基清除率与多酚呈显著正相关(P<0.05)外，DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率和还原力与多酚均呈极显著正相关(P<0.01)。表明糜子麸皮多酚与抗氧化活性之间密切相关，这与臧盛等[19]认为糜子壳粉中不同存在形式的多酚物质均具有抗氧化活性的结果相一致。

表4 抗氧化活性与多酚的Pearson相关分析结果

3 结论

采用超声波-微波协同方法提取糜子麸皮中的多酚，应用Box-Behnken中心组合实验设计进行工艺优化，最终确定最佳工艺条件为：液料比50∶1，乙醇体积分数60%，提取温度75 ℃，超声波功率1 000 W，微波功率为200 W的条件下提取10 min。在此工艺条件下，糜子麸皮中多酚的提取量为8.92 mg/g，与理论值9.06 mg/g接近，说明该提取工艺准确度高、重复性好，可用于糜子麸皮中多酚的提取。抗氧化活性实验表明，该多酚对DPPH自由基清除率，羟自由基清除率，超氧自由基清除率和还原力的IC50值分别为0.006、0.142、12.048、4.022 mg/mL，并且各个抗氧化活性指标和糜子麸皮多酚间均呈显著正相关(P<0.05)。