富血小板血浆在色素性皮肤病中的应用进展

王 涌，童学娅，周兴雯，归 冰，田文傲，马 晶，胡海彦，常心通

1 介绍

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）起源于70 年代，1977 年Harke 等[1]首次将全血分离制备出PRP，并且将其用于心脏外科手术患者，获得较好效果。1984 年Okuda 等[2]研究发现，PRP 中含有多种生长因子，且能促进骨缺损的修复。Matras[3]首次将纤维蛋白凝胶应用于口腔与颌面的外科修复中。Marx 等[4]将PRP 凝胶应用到颌面手术骨骼的修补中。自此以后，PRP 在临床中的研究日益增多，其广泛应用于烧伤、口腔医学、骨科、整形外科等专业[5-8]。当前的研究也表明，PRP 可以刺激皮肤真皮组织中成纤维细胞的活性，同时其可以模拟凝血过程，在该过程中，可以释放相关因子达到组织修复的作用。高浓度的血小板和生长因子（growth factor，GF）可加速组织的愈合过程[9,10]。

血小板作为来自于骨髓巨核细胞的细胞碎片，其特征是缺乏细胞核，每个血小板含有3 种颗粒，分别是α 颗粒、致密体和数量不等的溶酶体。其中α 颗粒中富含血管内皮活化因子、白细胞趋化因子、活化因子及组织修复相关的生长因子及抗菌肽等300 多种不同的蛋白质，它们参与伤口愈合、血管生成和机体抗感染免疫等多种生理及病理过程[11-13]。致密体中含有高浓度的二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、Ca2+、Mg2+和5-羟色胺。溶酶体含有多种糖蛋白酶，如糖苷酶、蛋白酶和阳离子蛋白及具有杀菌活性的蛋白质[11]。这些GF 在血小板活化后释放到血液中。GF 通过与不同类型的细胞膜受体结合后，触发级联反应，激活组织再生过程中的特定功能。当前研究较多的GF 是血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），转化生长因子-β（transforming growth factor，TGF-β），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），表 皮 生 长 因 子（epidermal growth factor，EGF），成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF），结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth facter，IGF-1）等。这些GF 通过促进细胞增殖分化、血管生成等过程来协助肌肉，肌腱，韧带等组织的修复，进而发挥相应作用[14,15]。

2 PRP的制备

PRP是从全血中分离获得的血小板浓缩物，其浓度是全血中血小板浓度的3～5倍[16]。当前报道的获取PRP的几种方法中，其在获取方式上无本质区别，通常会在离心力、离心次数、离心持续时间以及血小板活化剂的类型和浓度上有所差别。

离心作为收集PRP 的关键步骤，并无统一标准的离心方法。当前多采用密度梯度离心法制备PRP，其可分为两大类：单次离心法和两次离心法，部分学者认为单次离心就可以达到效果，但更多研究采用两次密度梯度离心法。第1 次离心将红细胞同血浆和白膜层分离，第2 次离心浓缩血小板，将其与贫血小板血浆进行分离[17-19]。目前文献中表述的两次离心的速度和时间差别较大。第1 次离心的离心力为100～900 g，离心时间4 ～15 min，第2 次离心的离心力400 ～3 000 g，离心时间8 ～20 min，这也造成了经常无法相互比较所获取的PRP 品质，进而无法相互比较其治疗效果，给临床及科研带来了较大的难题[20-22]。一般来讲，增加离心力和离心时间，可以增加PRP 中血小板的浓度，但是过度的提高离心速度，可能造成血小板激活而降低使用效果[23]。同时过高的温度会导致血小板的提前激活，所以，美国血库学会（American Association of Blood Banks，AABB）推荐 PRP 的离心温度为21 ～24℃。宣力等[24]介绍其利用两次离心法分离PRP 的方法，具体如下：将血液收集到离心管中，第1 次离心转速1 500 r/min（377 g），离心10 min。离心后血液分为3 层：上层为贫血小板血浆或乏血小板血浆（poor platelet plasma，PPP），中层为黄衣层，即为浓缩的血小板，下层为红细胞。用吸管吸取上层、中层以及邻近中层的部分红细胞，并将其移入另一无菌离心管中；第2 次以 3 000 r/min（1 509 g）、离心20 min。离心后离心管中液体分为两层，用吸管吸取上层约3/4 的PPP，下层即为PRP。将PRP 重悬、充分混匀，并对其分离出来的血小板进行血常规检测，显示出良好的分离效果。

对于血小板激活剂的选择，一般使用氯化钙，葡萄糖酸钙或凝血酶。关于这一步骤，Gómez 等[25]建议将比例为1:20（v/v）的10%氯化钙溶液进行激活。Vahabi 等[26]使用葡萄糖酸钙作为激活剂，通过比较激活的PRP 和未被激活的PRP 对体外成骨细胞和成纤维细胞的增殖能力测定发现，活化的PRP 对细胞增殖的影响要高于未活化的PRP，然而两者间并没有统计学差异，同时限于其样本量较少，仍需进一步研究。此外，没有确切的研究证实PRP 激活的时间与PRP 疗效之间关系的研究。Marx[27]研究提示，制备好的PRP，其可以稳定保存8 h。但是，血小板一旦被激活，其会在最初的10 min 内会释放70%的相关因子。这表明如果激活了PRP，则应尽快应用。否则，组织愈合过程中所需的GF 将会丢失。

3 PRP在色素性皮肤病中的应用

3.1 PRP 在白癜风中的应用

白癜风作为是一种常见的自身免疫性疾病，同时作为一种损容性皮肤病，对患者的心理造成了不良影响，严重影响了患者的生活质量。综合来说，白癜风的发生是遗传因素和环境因素相互作用引起皮肤黑素细胞被自身免疫系统攻击损伤造成的结果。目前白癜风的治疗方法虽然较多，但其疗效常常欠佳，且很多治疗方法缺乏循证医学的证据。近年来随着对白癜风发病机制的不断探索，一些新的治疗方法也在不断地得到应用。PRP 作为治疗白癜风的一种有效方法也得到了不断的应用。

3.1.1 光疗结合PRP 治疗白癜风 目前308 nm 准分子激光和311 nm 窄谱中波紫外线（narrow-band ultraviolet，NB-UVB）等光疗技术在白癜风患者中的疗效日益得到认可。

当前使用自体PRP 皮下微针注射联合光疗在稳定期白癜风患者中已经取得较大进展。Abdelghani等[28]在其研究中发现自体PRP 皮下微针注射联合NB-UVB 光疗可以显著缩短白癜风患者治疗的总时间。Khattab 等[29]将308 nm 准分子激光联合PRP 对稳定期非节段性白癜风患者进行治疗，取得了良好的效果。发现两者的结合可以有效提高白斑复色率，缩短了治疗时间，避免了长期使用308 nm 准分子激光照射的不良反应。李嘉等[30]研究也发现，使用自体PRP 微针注射联合308 nm 准分子激光治疗稳定期白癜风患者，获得了较好的疗效。其共纳入40 例稳定期白癜风患者，获得80 片皮损，分为观察组和对照组，所有患者皮损均予他克莫司软膏每日1 次外用，308 nm 准分子激光照射治疗，每周2 次，观察组另外给予自体PRP 每3 周1 次皮内微针注射，对照组给予生理盐水注射，连续治疗3 个月后对皮损区进行评价。结果显示观察组显效率77.50%，对照组显效率为52.50%，观察组显效率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。观察组不同部位皮损疗效比较结果显示，其在面颈部和躯干部的疗效最佳，肢端疗效最差。这些研究均提示PRP 与光疗联合是一种治疗白癜风的有效方法。但是，Ibrahim 等[31]研究也提示，单用PRP 治疗白癜风的疗效不佳。而Kadry 等[32]将PRP 联合二氧化碳点阵激光治疗白癜风的随机对照研究发现，PRP 联合二氧化碳点阵激光及单用PRP 均取得了良好的复色效果，其中以PRP联合二氧化碳点阵激光复色效果最好，单用PRP 白斑部位取得了中等程度的复色，单用PRP 的复色效果优于单用二氧化碳点阵激光治疗白癜风的效果。

3.1.2 手术联合PRP 治疗白癜风 白癜风是一类以色素脱失为特点的色素障碍性疾病。常规治疗方式包括药物治疗、光疗或手术治疗或者联合多种治疗方式等。对于稳定期白癜风及常规治疗效果不佳的患者，外科治疗可作为首选干预措施[33]。其中，表皮细胞混悬液移植治疗稳定期白癜风具有疗效肯定、治疗面积大、价格较低等优点。已被广泛应用于白癜风的治疗，效果令人满意，被认为是简单、安全的技术。

Garg 等[34]使用PRP 作为表皮细胞的悬浮剂，同时使用Er:YAG 激光对白斑部位进行磨削，在治疗稳定期白癜风患者中取得良好的治疗效果。该项研究共纳入10 例稳定期白癜风患者，获取20 个皮损部位。在20 个皮损区域，有12 个皮损区域（60%）出现完全的色素恢复，2 个皮损区域（10%）出现较大面积的色素恢复，4 个（20%）表现出中度色素恢复，以及2 个皮损区域（10%）无明显改善。腿部、膝关节、面部和颈部恢复最为明显，而肢端的恢复效果较差。Nimitha 等[35]使用PRP 悬浮表皮细胞制备成悬浮液与使用磷酸盐缓冲液悬浮的表皮细胞混悬液进行对比，观察两者在稳定性白癜风患者中的色素恢复。纳入21 例稳定期的白癜风患者，获取42 片白斑。白癜风病变的平均稳定时长为4.5 年。多数患者在治疗后的1 ～3 个月左右出现小圆形至椭圆形离散的色素恢复。在随访的6 个月中，PRP 组的平均色素恢复为75.6%，非PRP 组的平均色素恢复为65%。PRP 组和非PRP 组之间的色素恢复面积比较，差异具有统计学意义，PRP 组显示出更好的色素恢复。在分析节段型白癜风患者中的色素恢复率时，无论是PRP 组还是非PRP 组，差异均无统计学意义。然而，在非节段型白癜风患者中，PRP 组相比非PRP 组显示出更好的治疗效果，差异具有统计学意义（P=0.009）。该项研究提示将未培养的表皮细胞悬浮于PRP 中比悬浮在磷酸盐缓冲液中可以更显著的提高白癜风患者皮损区的平均色素恢复。

以上研究的结果表明，使用PRP 作为表皮细胞的悬浮液可以显著改善白癜风患者的手术效果，促进白斑部位的早期色素恢复，更好的治疗白癜风。然而，仍需要进行更加严格的随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）来确定该技术的有效性和安全性。

当前的研究发现白癜风患者白斑皮损处刺激黑素细胞活性的因子，如粒细胞-单核细胞集落刺激因子和碱性成纤维细胞生长因子水平明显下降[36,37]。同时，Shi 等[38]发现，碱性成纤维细胞生长因子通过激活磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶-Ras相关的C3 肉毒素底物1-黏附斑激酶-c-Jun N 末端激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/Serine/threonine kinase-Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1-Focal adhesion kinase-c Jun N-terminal kinase，PI3K/Akt-Rac1-FAK-JNK）和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信号传导途径促进黑素细胞迁移，血小板在激活过程中可以释放多种生长因子；PRP 中含有的多种生长因子能够改善白癜风患者皮损处的微环境，更好的促进移植后表皮细胞的成活和皮损部位的色素恢复。

3.2 PRP 在黄褐斑中的应用

黄褐斑（melasma）是一种面部获得性色素增加性皮肤病，多发生于频繁暴露于紫外线下肤色较深的女性面部。皮损常分布对称，发展缓慢，可持续多年。其发病机制尚未完全阐明，治疗困难，易复发[39]。当前，黄褐斑的治疗多采用联合治疗的方法，包括：系统药物治疗、局部药物治疗、化学剥脱、物理治疗、中医中药治疗等方法。

3.2.1 皮下注射PRP 治疗黄褐斑 虽然黄褐斑的治疗手段多样，但患者的疗效并不十分满意，且停止治疗后易复发。并且口服药物如氨甲环酸和谷胱甘肽，可能导致腹胀，月经周期紊乱，头痛，甚至深静脉血栓的形成[40]。探索出治疗黄褐斑新的治疗方法，是当前黄褐斑研究的重要方向。

当前有研究报道使用PRP 可以显著改善黄褐斑患者皮损状况。Cayırlı 等[41]报道了1 例27 岁的女性，每隔15 d 进行1 次PRP 的皮下微针注射，在第3 次PRP 治疗结束时，观察到表皮色素恢复面积＞80%，且6 个月内无复发。同样，Sirithanabadeekul等[42]使用PRP 治疗黄褐斑的有效性进行更严格的RCT，进一步证实了皮内PRP 注射治疗黄褐斑的有效性。Hofny 等[43]通过对黄褐斑患者皮损部位皮下微针注射PRP 后和正常部位使用免疫组化的方法进行TGF-β 蛋白表达的对比发现，在进行PRP 治疗之前，黄褐斑患者的皮损部位和皮损部位周围TGF-β蛋白的表达显著低于健康皮肤（P＜0.05）。PRP 治疗后，黄褐斑患者的皮损部位TGF-β 蛋白的表达明显增加。该现象说明PRP 对黄褐斑患者的改善作用可能通过提高皮损部位的TGF-β 蛋白的表达达到对黄褐斑的治疗作用。

3.2.2 光电技术联合皮下注射PRP 治疗黄褐斑 近年来，随着光电技术的不断发展，其在黄褐斑的治疗中所扮演的角色越来越引起研究者们的重视。当前应用于治疗黄褐斑的激光包括：Q 开关激光、点阵激光、强脉冲光、溴化亚铜激光等治疗措施[44]。其原理是，通过在能量上的选择针对黑素细胞内或细胞间的黑素颗粒进行选择性光爆破，通过低能量、多次光爆破作用使黑素细胞功能失活或抑制，同时黑素颗粒的多次光爆破，可以使黑素颗粒更微小化，更有利于被机体吞噬排出。

苏碧凤等[45]通过PRP 水光注射联合Q 开关Nd:YAG 1064nm 激光对黄褐斑进行的临床治疗发现，在纳入的100 例黄褐斑患者中，PRP+激光组中基本治愈15 例，显效22 例，好转11 例，无效1 例；单独应用激光组中基本治愈8 例，显效21 例，好转18例，无效3 例，两组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。彭国凯和宋继权[46]对调Q 激光联合PRP治疗面部黄褐斑的有效性进行进一步的验证，结果表明调Q 激光联合PRP 治疗面部黄褐斑有疗效，但是其具体机制暂不明确，这为黄褐斑的治疗提供了新思路。但是，关于PRP 联合激光在黄褐斑中的治疗效果仍需要更严格的RCT 来证实。

4 展望

根据当前PRP 在色素性皮肤病中的研究可知，PRP 在治疗黄褐斑的可能机制是：PRP 通过增加皮损部位TGF-β 蛋白的表达起到对黄褐斑患者的改善作用。

而PRP 对白癜风患者皮损处的改善作用可能与血小板中的α 颗粒分泌的黏附分子和细胞因子改善了白癜风患者皮损部位的局部微环境有关。白癜风的发病与皮损部位的免疫异常密切相关，李春英和李舒丽[47]研究发现白癜风患者的局部免疫异常与皮损部位的角质形成细胞和黑素细胞无法对抗细胞内氧化应激过程中释放的多种炎性因子、趋化因子对黑素细胞造成损伤有关。而PRP 中分泌的多种血小板生长因子以及血小板释放的多种抗炎细胞因子，如白细胞介素（IL）-1 受体拮抗剂（IL-1 receptor antagonist，IL-1ra）、可溶性肿瘤坏死因子受体（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNF-R）I、IL-4、IL-10，在调节皮损部位局部免疫平衡方面可能发挥了一定的作用[28]。

当前，学者们对于PRP 的效果存在争议，有大量文献报道了PRP 所取得的良好效果，也有文献报道PRP 作用有限。但是当前的多数研究并没有对PRP 的制备及其质控方法进行详细说明，这造成制备出的PRP 质量参差不齐，影响了对其疗效的观察。Chahla 等[48]分析了2006—2016 年10 年间的105 项有关PRP 的研究发现，仅有10%的研究提供了详细的PRP 制备方法，16%的研究提供了PRP 产品具体的量化指标。所以当前那些认为PRP 没有作用的相关文献，部分原因可能是其研究的设计、执行、评估方法存在不科学、不严谨造成的，更大的问题可能是制备出的PRP 不合格。也就是同一研究中使用的PRP 不具有均质性，造成实验或临床效果不稳定或缺乏可比性[23]。这也是造成当前PRP 在色素性皮肤疾病中的研究出现较大差异的原因之一。因此在应用PRP 治疗之前，需要对患者的情况进行统一评估，同时对所获取的血小板数量和质量进行严格的把控，以保证对PRP 疗效进行更加客观的评价。