Akkermansia muciniphila的培养方法及其在疾病治疗中应用的研究进展

楚福英, 李元敬, 王雨亭, 施树良, 张彦龙, 雷 虹,*, 李文辉,*

(1. 黑龙江大学 生命科学学院 黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室, 哈尔滨 150080; 2. 黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心, 哈尔滨 150500; 3. 华南师范大学汕尾校区 海洋与环境工程学院, 广东 汕尾 516600; 4. 哈尔滨工业大学 生命科学与技术学院，哈尔滨 150001)

0 引 言

动 物 胃肠道系统中有大量微生物在此定殖，例如拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Phylum Firmicutes)等，其中定殖在胃肠道中更加丰富的菌群是Verrucomicrobia。因为动物胃肠道内会形成一种黏液层，其组成成分主要是黏蛋白。肠道菌群中属于 Verrucomicrobia，阿克曼氏菌属(Akkermansia)的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)能够特异性的降解黏蛋白[1]，还能以黏蛋白为唯一碳源和氮源，产生短链脂肪酸来为宿主提供能量[1-2]。2004年由Derrien利用黏蛋白培养基首次从人体粪便中分离出来，在人类肠道普遍定殖，是人类肠道微生物中最丰富的成员之一，约占总量的3%～5%[3-6]。肠道黏液层至少存在8种不同的Akkermansia在此定殖[1]。

目前已发现的属于Akkermansia的细菌只有2种A.muciniphila和A.glycaniphila，其中A.glycaniphila只在网纹蟒体内被检测到并成功分离，并未在哺乳动物中发现[7]。而A.muciniphila在小鼠[2,8]、驴[9]、人类[3,8,10]等动物的粪便中均被检测到，是Verrucomicrobia中第一个被成功分离和鉴定的肠道细菌，并广泛分布于多种动物的肠道内。目前发现哺乳动物中的Akkermansia均为A.muciniphila[4,11]。近年来，在动物和人类研究中，A.muciniphila的变化显然与各种疾病(肥胖、早衰、阿尔兹海默症等)的发生发展密切相关，并且在其中发挥重要作用[12-13]。有学者指出A.muciniphila有望成为下一代益生菌[6,13]。本文综述了A.muciniphila的培养方法及其与肥胖、早衰、阿尔兹海默症这几种疾病之间的关系。

1 A. muciniphila的培养方法

A.muciniphila作为一种严格厌氧的革兰氏阴性菌，很难在普通培养基中生长繁殖，对起始存在的环境、培养的条件和操作方法等均要求严格[4]。研究表明，A.muciniphila在分别以黏蛋白、果糖、半乳糖、纤维二糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡萄糖胺作为碳源的培养基中生长情况分别为最佳生长、不生长、不生长、不生长、微弱生长、微弱生长、微弱生长[3]。A.muciniphila的培养条件是在温度20～40 ℃和pH 5.5～8.0之间，其中37 ℃是最佳温度、6.5是最佳pH值，pH<5.5或>8.0都不生长，并且需要严格的厌氧环境才能生长(182 kPa、20%CO2、80%N2)。在以寡糖(葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺)为碳源的培养基上生长缓慢，在黏蛋白基础培养基上生长状况最佳，到目前为止黏蛋白基础培养基是其唯一的选择性培养基[3-4]。

2004年，Derrien等[3]首次提到了适用于A.muciniphila培养的基础碳酸氢盐缓冲培养基。该培养基中含有：0.4 g KH2PO4；0.53 g Na2HPO4；0.3 g NH4Cl；0.3 g NaCl；0.1 g MgCl2·6H2O；0.11 g CaCl2；1 mL 维生素溶液；1 mL碱性微量元素溶液；1 mL酸性微量元素溶液；0.5 mg刃天青；4 g NaHCO3；0.25 g Na2S·7-9H2O 。在该培养基中还添加了0.7%(v/v)的澄清无菌瘤胃液和0.25%(v/v)的猪胃粘蛋白，称之为“黏蛋白培养基”。后来的研究发现瘤胃液和维生素并不是该菌株生长所必需的。MucT菌株也在脑心浸液培养基(BHI)和哥伦比亚肉汤培养基中生长，但在这些培养基中细菌的生长密度只是黏蛋白培养基中的1/2[3]。

目前对于A.muciniphila的培养大多依赖于由猪胃黏蛋白和牛脑心浸液干粉配制而成的培养基，虽然培养效果好，但成本较高[14-15]。2016年，Plovier等[16]改造了黏蛋白基础培养基，用浓度为25 mmol·L-1混合糖(葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺)、16 g·L-1大豆蛋白胨以及4 g·L-1苏氨酸来替代黏蛋白，结果发现培养效果与黏蛋白基础培养基相似。

近几年有大量学者发明了关于培养A.muciniphila的培养基。2019年，彭永正等[14]发明了一种培养A.muciniphila的培养基，该培养基组分包括大豆蛋白胨、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、苏氨酸、磷酸氢二钠和氯化钠，在厌氧箱中培养3～4 d，得到了纯的A.muciniphila。王敏等[17]发明了一种A.muciniphila的低氧培养方法，这种方法特异性的营造出一种低氧的培养环境，其中各种混合气体的体积比是：70%～94%N2、1%～5%O2、5%～25%CO2，培养时间为24～36 h。该发明提供了一种全新的、氧气浓度较高的、更适合A.muciniphila生长的低氧混合气体。对比传统的绝对无氧环境和现有的微氧环境，该专利的发明方法使A.muciniphila进入稳定期的时间大为缩短，并且这一低氧环境，对于不同的培养基，可展现出类似的促进作用。2020年，朱永亮等[15]发明了一种新的培养A.muciniphila的培养基,此培养基的成分包括脑心浸液、猪胃黏蛋白、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、苏氨酸、L-半胱氨酸盐和维生素。该培养基可使A.muciniphila在含有较低浓度的猪胃黏蛋白和脑心浸液的培养基中仍然能够获得充足的营养物质，来保证菌株的正常生长。2021年，王敏等[18]又发明了一种A.muciniphila的厌氧培养方法，所采用的混合气体比例是85%～94%N2、5%H2、1%～10%CO2，所采用的是改良的BHI培养基，即在其中添加了黏蛋白和酵母膏。该专利中发明的培养方法使A.muciniphila的生长繁殖不受液面高度的限制，使其能在摇瓶和平板表面生长良好，降低培养难度。同时该方法使A.muciniphila的培养时间由传统的3～4 d缩短为24～36 h，对A.muciniphila的扩大培养和深入研究均有重大意义。

培养基中既使不添加黏蛋白，A.muciniphila在其中也能正常生长。且A.muciniphila在这些培养基上的培养效果与黏蛋白基础培养基能达到相似效果，甚至培养效果更好、难度更小、时间更短、成本更低，使体外实验和动物实验更易进行。目前培养A.muciniphila的方法还在不断探索，对于A.muciniphila的分离方法及其与各种疾病之间关系的研究意义重大。

2 A. muciniphila与各种疾病之间的关系

2.1 A. muciniphila与早衰的关系

肠道是受衰老过程影响的器官之一，老年人群中肠道疾病的发生率相当高[19]。作为肠道的主要居民，肠道微生物群在维护健康方面发挥着重要作用。在衰老过程中，肠道菌群组成发生重大变化，如有益菌减少，致病菌增加，其中A.muciniphila的显著降低引起了人们的广泛关注[20]。有研究表明，A.muciniphila的分布与年龄有关，且随着年龄的增加而降低，与成年人相比，老年人肠道内该细菌的定殖量显著降低[1,13]。A.muciniphila与动物的早衰也密切相关，且A.muciniphila在其中起到益生菌的作用，可延长早衰动物的寿命[21]。

Barcena C等[21]发现肠道菌群失调在两种不同的早衰症小鼠模型中表现尤为明显，其变化主要包括疣微菌丰度显著降低。与这些发现相似的是，肠道菌群失调是人类早衰症患者表现出的现象之一，但值得注意的是，长寿的人(百岁老人)却表现出疣微菌的显著增加。测试了向LmnaG609G/G609G小鼠提供A.muciniphila是否会延长它们的寿命，并对百岁老人的肠道菌群进行宏基因组分析。结果表明，A.muciniphila对早衰症状具有有益作用，会使寿命延长。因口服A.muciniphila可以延长早衰小鼠的寿命，并且有利于肠粘膜层的增厚[22]。接受A.muciniphila的LmnaG609G/G609G小鼠也显示肠三叶因子Tf3的增加，这能促进伤口愈合和粘膜层的修复[23]。该研究表明了A.muciniphila的给药会使早衰症患者寿命延长，从而拓展了以前关于Akkermansia在哺乳动物和老年小鼠肠道中能促进健康的研究结果[21,24]。

Van der Lugt B等[25]通过给老化的Ercc1/δ7小鼠补充70 d的A.muciniphila，并研究了肠道健康的组织学和免疫学方面。结果发现结肠黏液层的厚度在补充A.muciniphila后增加了3倍，比补充植物乳杆菌WCFS1的小鼠更厚。结肠基因表达谱表明，炎症和免疫功能相关基因和途径的表达减少，并表明结肠中B细胞减少。补充A.muciniphila后，脾和肠系膜淋巴结中的总B细胞未变。骨髓中成熟和未成熟的B细胞增加，而B细胞前体则不受影响。这些发现表明A.muciniphila影响了B细胞的迁移而不是产生。回肠中的基因表达谱表明，补充A.muciniphila后，代谢和免疫相关过程以及抗菌肽的产生减少。此外，A.muciniphila降低了淋巴结中活化的CD80+CD273-B细胞的数量。此外，腹膜常驻巨噬细胞数量的增加，脾和肠系膜淋巴结中Ly6Cint单核细胞数量的降低为A.muciniphila的潜在抗炎特性提供了证据[25]。

以上这些结果支持A.muciniphila在老龄人群中的治疗应用，并为衰老疾病的治疗提供了一种新型治疗方法。进一步的研究可集中在人类应用的实际方面，如剂量、频率和给药方式等，尽快提供一种高效且无毒副作用的治疗方法。

2.2 A. muciniphila与肥胖的关系

随着人们生活水平的提高，肥胖的发病率也在逐年升高，最近的研究发现肥胖的发生与肠道菌群紊乱，炎症和肠道屏障破坏等症状密切相关。虽然在肥胖期间影响上述症状的微生物组成与宿主之间的作用机制尚不明确，但却发现肠道菌群中的A.muciniphila在其中起到重要作用，口服A.muciniphila治疗能明显改善肥胖的症状[25]。

目前A.muciniphila的研究也多与肥胖有关，高脂喂养的小鼠与正常小鼠的A.muciniphila丰度明显不同[24,26]。Schneeberger M等[24]已经证明，肠道细菌在肥胖过程中发生了特定变化，在高脂饮食(High-fat diet, HFD)喂养下A.muciniphila的丰度降低。随着肥胖的加重，A.muciniphila的水平与几乎所有涉及脂肪酸氧化和脂肪褐变的参数呈强正相关。相反，在此过程中还发现A.muciniphila的水平与炎症标记物、脂质合成以及胰岛素抵抗、心血管风险和肥胖症的几种血浆标记物呈负相关。随着小鼠饮食治疗时间的延长，A.muciniphila的丰度逐渐下降，而这种影响在HFD中会加剧。

Everard等[26]证明了A.muciniphila在肥胖中发挥着重要作用，其丰度在肥胖小鼠中显著降低，并且观察到用低聚果糖喂养遗传性肥胖小鼠可使其体内A.muciniphila丰度增加近100倍，这与代谢状况的改善有关。除此之外，还证明了口服A.muciniphila治疗改善了高脂饮食诱导的代谢紊乱，包括脂肪组织炎症、脂肪量增加、代谢性内毒素血症和胰岛素抵抗。同时证明了只有活的A.muciniphila能实现这些效果，热杀死的A.muciniphila并不能改善代谢紊乱。

虽然Everard等已经表明热杀死的A.muciniphila消除了有益效果，但最近的研究表明，益生菌在70 ℃巴氏杀菌30 min的情况下，可以部分或完全保留其有益效果[16,26]。Plovier H[16]等评估了在合成培养基上生长并经巴氏杀菌灭活的A.muciniphila的效果。结果发现经过巴氏杀菌的A.muciniphila独立于食物摄入并发挥了比活菌更强的作用，用巴氏杀菌的A.muciniphila处理的HFD小鼠显示出与用对照饮食(control diet, ND)喂养的小鼠相似的体重和脂肪量增加。在两组实验中，与HFD组相比，处理的HFD小鼠表现出更低的葡萄糖不耐受和胰岛素浓度，这导致处理小鼠的胰岛素抵抗指数较低。处理的HFD小鼠与ND小鼠相比其回肠中的杯状细胞密度更大，这表明处理的HFD小鼠产生了更多的黏液。此外，当将处理的HFD小鼠与未经处理的HFD小鼠进行比较时，其平均脂肪细胞直径标准化，血浆瘦素显著降低。在用活A.muciniphila处理的小鼠中未观察到这些现象。与其他组相比，处理组的HFD小鼠粪便热量含量更高，表明其能量吸收更低，这有助于该组中小鼠体重和脂肪量降低。 另有研究表明，通过用454焦磷酸测序法分析16S rRNA基因序列可用来评估二甲双胍对肠道微菌群组成的影响。结果表明用二甲双胍处理的HFD喂养的小鼠显示出比HFD喂养的对照组小鼠更高的黏蛋白降解细菌A.muciniphila的丰度，且肥胖症状得到明显改善，说明二甲双胍治疗可以显著增加了A.muciniphila的数量来改善肥胖[27]。

以上研究表明，不管是活的还是经巴氏杀菌过的A.muciniphila均在治疗肥胖上发挥重要作用，且经过外物(二甲双胍等)的干预可以辅助治疗，加强治疗效果。虽然A.muciniphila在肥胖的治疗过程的具体机制尚不清楚，但这些成果均为预防或治疗肥胖及其相关疾病提供了重要的理论依据，为肥胖的治疗提供一条新的途径。

2.3 A. muciniphila与阿尔兹海默症(AD)的关系

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以广泛性痴呆为特征的疾病，如记忆障碍、视觉功能丧失、行为改变等[28]。目前全球对AD的治疗只能缓解其症状，还未有有效的方法来缓解疾病的进展[29-30]。早期诊断是最有效的治疗方法。2010年，阿尔茨海默病国际报告称，全球的痴呆症治疗和护理费用已经超过8 180亿美元。且有专家推测，2050年[31]，AD患者的数量可能会达到3 000万，其中近71%的患者主要集中在发展中国家，包括南亚、中国、印度和西太平洋地区。

淀粉样蛋白β(β amyloid, Aβ)是Aβ前体蛋白(β amyloid precursor protein, APP)通过β-和γ-分泌酶的蛋白水解产生的肽。Aβ40和Aβ42的毒性均很强，容易聚集在一起并引发神经毒性效应，被广泛认为是AD的关键生物标志物，诊断AD的基本神经病理学标准是细胞外Aβ的沉积和细胞内过度磷酸化蛋白沉积，与多种病理特征有关[32-33]。代谢综合征，包括肥胖和胰岛素抵抗等，也是影响AD的关键高危因素[34-37]。前面已经提到A.muciniphila对肥胖和胰岛素抵抗等都具有改善作用。且有研究表明，AD患者和正常人之间的肠道微生物组成存在重大差异，其中A.muciniphila在AD小鼠肠道中丰度明显降低[32,34]。因此，通过饮食、益生菌或粪菌移植可能是AD的潜在治疗方法[35]。

Ou Z等[32]用正常饮食和HFD喂养APP/PS1小鼠，每天灌胃A.muciniphila，连续6个月，研究了A.muciniphila对AD小鼠模型糖代谢、肠屏障和脂代谢的影响，分析了脑病理学和神经行为学的变化。结果发现A.muciniphila能有效改善AD模型小鼠的糖耐量、肠屏障功能障碍和血脂异常，延缓AD模型小鼠脑内病变，减轻空间学习记忆障碍。欧子豪等[34]的研究表明A.muciniphila给药能显著降低AD模型小鼠体内的血清二胺氧化酶和空腹血糖水平，缓解结肠粘液细胞数量降低的症状。但在治疗过程中也发现A.muciniphila并未缓解AD模型小鼠体重的增加，但却能使血脂水平降低，还可改善肩部棕色脂肪白色化和肝脂肪变性，降低海马中Aβ蛋白的沉积和大脑皮层的Aβ40-42水平，AD模型小鼠Y型迷宫的学习时间减少且准确率提高，有效缓解其自身认知能力所造成的损害。

综上所述，虽然目前对于A.muciniphila与AD之间的关系鲜有报道且其作用机制尚不清楚，上述研究均证明了A.muciniphila能够显著改善AD的症状，为AD的防治提供了一种新的治疗策略。A.muciniphila还在炎症性肠病[11,36-37]、Ⅱ型糖尿病[26,38]、酒精性脂肪肝[5,39]、宿主免疫反应[27,40]、帕金森[41-42]等患者的治疗方面发挥重要作用。且王淼[43]的研究表明缺铁性贫血小鼠与正常小鼠相比，其体内A.muciniphila丰度显著降低，表明A.muciniphila可能在缺铁性贫血的治疗方面发挥作用。然而其对各种疾病影响的具体机制尚不清楚。

3 结论与展望

A.muciniphila作为肠道菌群中一种潜在益生菌，培养难度较大，随着研究的深入，其培养方法也逐渐优化，不仅在厌氧环境中的培养技术越来越成熟，还掌握了在低氧环境中的培养方法，使培养时间和培养难度大大降低，与之相关的研究内容和方向也越来越多。目前的研究主要集中在各种疾病(衰老、肥胖、阿尔兹海默症等)的治疗方面，发现A.muciniphila能够显著改善这些疾病的症状，将为这些疾病的治疗提供一条新思路。全面了解A.muciniphila在相关疾病发生、发展过程中的变化规律，进而阐明其发挥作用的具体机制尤为重要。通过口服或粪菌移植等方法探究A.muciniphila治疗上述各种疾病的具体机制，早日为各种疾病的治疗提供一条无毒副作用的新途径。