miR-195靶向MYB激活PI3K-Akt通路调控皮肤鳞癌细胞增殖与恶性转移

代永霞， 任杰， 崔庆标， 李露， 陈晓宇

(1.河南省第二人民医院皮肤科，河南 郑州 451191;2.郑州大学基础医学院，河南 郑州 450001)

皮肤鳞癌是起源于表皮或附属器的一种恶性肿瘤，多见于50岁以上老年人，好发于头面部[1]。常发生于某些皮肤癌前病基础上，或由各种癌前病演变而来，少数为原发性[2]。早期皮肤鳞癌患者采用手术、光动力及放化疗等治疗，但由于癌细胞易发生转移或对放射化疗不敏感，导致患者晚期预后不良。因此，从分子角度深入探讨皮肤鳞癌的发展机制至关重要。microRNAs (miRNAs)是一组非编码的小RNA(长度约22 nt)，通过调节特定mRNA靶点的活性，在人类疾病的发生过程中发挥重要作用[3-4]。miRNAs参与细胞分化、增殖和凋亡等生物学过程，这些过程在癌症发展中非常重要[5-6]。多项研究表明，miRNA的调控异常与癌症的发生发展有关，包括肝癌中的miR-122、结直肠癌中的miR-25、乳腺癌中的miR-125b[7-9]。此外，也有miRNA在皮肤鳞癌发病机制中的报道，如miR-373表达下调明显抑制皮肤鳞癌A431细胞的侵袭，并能明显下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达[10]。因此，皮肤鳞癌中miRNA靶点的识别至关重要。miR-195位于染色体17p13.1上6881953～6862065 bp之间，属于microRNA-15/16/195/424/497家族[11]。广泛的研究表明，miR-195在许多肿瘤中解除调节并发挥肿瘤抑制作用，包括肺癌、肾上腺皮质癌和结肠癌[12-13]。然而，miR-195在皮肤鳞癌细胞中的作用尚不清楚，因此本研究拟探讨miR-195在皮肤鳞癌细胞中的作用，为进一步阐明其在皮肤鳞癌中发挥的调控作用奠定基础。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、设备

A431细胞(上海通派生物科技有限公司)；HaCaT细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；DMEM培养基(中国赛默飞世尔科技公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；蛋白裂解液、点突变试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗(上海碧云天生物有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本Takara公司)；Bax、Bcl-2、GAPDH、钙粘附蛋白E、钙粘附蛋白N抗体(上海圣克鲁斯生物公司)；实验中用到的质粒由GenePharma公司合成。 荧光定量 PCR仪(美国 Thermo Fisher Scientific公司)； 蛋白电泳仪、 蛋白半干转印槽(美国伯乐公司)；37 ℃恒温培养箱(黑龙江东拓仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A431细胞和HaCaT细胞在含有10% FBS和青霉素、链霉素的DMEM培养基中培养，细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养，细胞长满后进行消化传代培养。

1.2.2 细胞转染 显微镜下观察细胞长到95%后，加入PBS进行清洗，再用胰酶消化细胞，将稀释后的细胞按1×105个/孔的细胞密度铺到12孔板，细胞密度达70%时，用Turbofect试剂转染组质粒，在37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h，收集各组细胞RNA样和蛋白样。

1.2.3 CCK-8法检测miR-195、MYB对细胞增殖的影响 显微镜下观察细胞长到95%后，加入PBS进行清洗，再用胰酶消化细胞，将稀释后的A431细胞铺于96孔板中，细胞汇合达70%～80%时，通过Turbofect转染质粒，转染组分为：①对照组;②mimics NC组；③miR-195 mimics组;④inhibitor NC组;⑤miR-195 inhibitor组;⑥阴性对照组(siRNA NC);⑦MYB siRNA组;⑧过表达对照组[pcDNA-3.1(+)];⑨pcDNA-MYB组;⑩MYB过表达+LY294002组[pcDNA-MYB+LY294002(20 μmol/L)],在37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h，PBS清洗细胞，小心滴加10 μL CCK-8工作液至细胞内，孵育2 h，在酶标仪读取各孔细胞在450 nm处的吸光值。

1.2.4 双荧光素酶报告基因活性检测细胞的荧光素酶活性 TargetScan预测miR-195的潜在靶基因，构建MYB wt载体，再通过点突变试剂盒构建MYB mut载体。将状态良好的A431细胞接种于12孔板，细胞汇合至70%～75%时，利用Turbofect试剂将MYB wt、MYB mut分别与miR-195mimics、mimics NC质粒共转染至A431细胞，48 h后利用双荧光素酶报告基因盒测定细胞的荧光素酶活性。

1.2.5 RT-qPCR检测细胞内miR-195、MYB的表达 分别用mimics NC、miR-195 mimics、inhibitor NC、miR-195 inhibitor、siRNA NC、MYB siRNA、pcDNA-3.1(+)、pcDNA-MYB重组质粒转染细胞，同时设置未转染组细胞作为对照。48 h后收取细胞RNA样品和培养的A431细胞、HaCaT细胞，利用Trizol法提取细胞总RNA，RNA溶液浓度和纯度测定正确后，反转录总RNA为cDNA。以cDNA为模板，按照预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环的程序，进行实时荧光定量PCR，实验结果使用GAPDH为内参，2-△△Ct法分析各组A431细胞、HaCaT细胞内miR-195和MYB的表达量。实验所用的引物见表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.6 Western blot检测miR-195、MYB对Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin表达的影响 分别用mimics NC、miR-195 mimics、inhibitor NC、miR-195 inhibitor、siRNA NC、MYB siRNA、pcDNA-3.1(+)、pcDNA-MYB重组质粒转染细胞，另外一组细胞将LY294002(20 μmol/L)作用细胞12 h后转染pcDNA-MYB质粒，同时设置未转染组细胞作为对照。48 h后收取细胞蛋白样品，用裂解液充分裂解细胞。BCA法测定上清蛋白样品的浓度后，每个孔50 μg点样，参照75 V 30 min、120 V 1.5 h的程序进行SDS-PAGE凝胶电泳。分析Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin的表达量。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达miR-195抑制A431细胞增殖和EMT

结果显示，A431细胞中miR-195的表达量明显低于HaCaT细胞(t=14.70，P=0.005)。miR-195 mimics组的miR-195表达量较对照组或mimics NC组明显升高(t值分别为13.80、14.75，P值均<0.01)，说明miR-195 mimics质粒在细胞内表达成功。miR-195 mimics组的细胞增殖能力明显降低(t值分别为9.20、9.20，P值均<0.05)，Bax蛋白表达量明显上升(t值分别为20.40、21.58，P值均<0.01)，Bcl-2蛋白表达量明显下降(t值分别为21.87、22.63，P值均<0.01)，E-cadherin蛋白表达量明显上升(t值分别为9.24、9.25，P值均<0.05)，N-cadherin蛋白表达量明显下降(t值分别为12.56、12.72，P值均<0.01)，详见图1A～1G。表明miR-195在A431细胞中低表达，过表达miR-195抑制了A431细胞的增殖和EMT。

2.2 下调miR-195促进A431细胞增殖和EMT

与对照组或inhibitor NC组相比，miR-195 inhibitor组的miR-195表达量明显降低(t值分别为10.83、10.89，P值均<0.01)，细胞增殖能力增强(t值分别为9.08、9.09，P值均<0.05)，Bcl-2蛋白表达量明显上升(t值分别为16.22、16.57，P值均<0.01)，Bax蛋白表达量明显下降(t值分别为14.86、14.93，P值均<0.01)，N-cadherin蛋白表达量明显上升(t值分别为10.85、11.73，P值均<0.01)，E-cadherin蛋白表达量明显下降(t值分别为20.54、21.63，P值均<0.01)，详见图2A～2F。表明下调miR-195促进了A431细胞的增殖和EMT。

图1 过表达miR-195抑制A431细胞增殖和EMT 1A：RT-qPCR检测miR-195在HaCaT和A431细胞中的表达；1B：RT-qPCR检测过表达miR-195后A431细胞中miR-195的表达量；1C：CCK-8检测过表达miR-195对A431细胞增殖的影响；1D：Western blot检测过表达miR-195对A431细胞内Bcl-2和Bax表达的影响；1E：Bcl-2和Bax蛋白相对表达量；1F：Western blot检测过表达miR-195对A431细胞内E-cadherin、N-cadherin表达量的影响；1G：E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量

2.3 miR-195与MYB的靶向和调控关系

预测miR-195和MYB之间的结合位点见图3A。当质粒携带MYB 3’UTR wt时，miR-195的荧光素酶活性明显降低(t=15.87，P=0.004)；携带MYB 3’UTR mut时，miR-195的荧光素酶活性无变化(P>0.05)。表明MYB是miR-195在A431细胞中的下游靶点。与对照组或mimics NC组相比，miR-195 mimics组MYB表达量明显降低(t值分别为15.81、16.25，P值均<0.01)，而miR-195 inhibitor组MYB表达量明显升高(t值分别为18.37、17.58，P值均<0.01)，详见图3B、3C。表明miR-195与MYB之间具有靶向和负调控关系。

2.4 下调MYB抑制A431细胞增殖和EMT

RT-qPCR结果显示，A431细胞中MYB的表达量明显高于HaCaT细胞(t=16.02，P=0.004)。在细胞内表达MYB siRNA质粒后，与对照组或siRNA NC组相比，MYB siRNA组的MYB表达量明显降低(t值分别为18.37、18.53，P值均<0.01)，细胞增殖能力明显降低(t值分别为9.03、9.04，P值均<0.05)，Bax蛋白表达量明显上升(t值分别为13.48、13.27，P值均<0.01)，Bcl-2蛋白表达量明显下降(t值分别为17.63、18.54，P值均<0.01)，E-cadherin蛋白表达量明显上升(t值分别为23.41、22.37，P值均<0.01)，N-cadherin蛋白表达量明显下降(t值分别为14.84、15.26，P值均<0.01)，详见图4A～4G。表明MYB在A431细胞中高表达，下调MYB抑制了A431细胞的增殖和EMT。

2.5 MYB通过PI3K-Akt通路调控A431细胞的增殖和EMT

结果显示，与对照组或pcDNA-3.1(+)组相比，pcDNA-MYB组细胞内MYB表达量明显升高(t值分别为16.12、17.48，P值均<0.01)，说明pcDNA-MYB质粒在细胞内表达成功；与pcDNA-3.1(+)组相比，pcDNA-MYB组细胞内PI3K、Akt蛋白磷酸化水平明显升高，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明显升高(t值分别为18.76、13.26，P值均<0.01)；细胞增殖能力明显升高(t=10.77，P=0.009)，Bax蛋白表达量明显降低(t=12.74，P=0.006)，Bcl-2蛋白表达量明显升高(t=12.72，P=0.006)，E-cadherin蛋白表达量明显降低(t=16.54，P=0.004)，N-cadherin蛋白表达量明显升高(t=14.64，P=0.005)。LY294002作用细胞后,pcDNA-MYB+LY294002组与对照组相比，细胞PI3K蛋白磷酸化水平明显受到抑制(t=21.06，P=0.002)；与pcDNA-MYB组相比，细胞增殖能力明显降低(t=13.94，P=0.007)，Bax蛋白表达量明显升高(t=15.62，P=0.004)，Bcl-2蛋白表达量明显降低(t=13.63，P=0.004)，E-cadherin蛋白表达量明显升高(t=13.87，P=0.003)，N-cadherin蛋白表达量明显降低(t=13.19，P=0.006)，详见图5A～5J。表明过表达MYB能够激活细胞内PI3K-Akt通路，从而促进A431细胞的增殖和EMT。

图2 下调miR-195促进A431细胞增殖和EMT 2A：RT-qPCR检测下调miR-195后A431细胞中miR-195的表达量；2B：CCK-8检测下调miR-195对A431细胞增殖的影响；2C：Western blot检测下调miR-195对A431细胞内Bcl-2和Bax表达的影响；2D：Bcl-2和Bax蛋白相对表达量；2E：Western blot检测下调miR-195对A431细胞E-cadherin、N-cadherin表达量的影响；2F：E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量

图3 miR-195与MYB的靶向和调控关系 3A：TargetScan预测miR-195的潜在靶基因；3B：双荧光素酶报告基因活性检测；3C：RT-qPCR检测过表达或下调miR-195对A431细胞内MYB表达的影响

图4 下调MYB抑制A431细胞增殖和EMT 4A：RT-qPCR检测MYB在HaCaT和A431细胞中的表达量；4B：RT-qPCR检测下调MYB后A431细胞中MYB的表达量；4C：CCK-8检测下调MYB对A431细胞增殖的影响；4D：Western blot检测下调MYB对A431细胞内Bcl-2、Bax表达的影响；4E：Bcl-2和Bax的相对表达量；4F：Western blot检测下调MYB对A431细胞内E-cadherin、N-cadherin表达量的影响；4G：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相对表达量

3 讨论

越来越多的研究表明miR-195在多种癌症中异常表达，说明miR-195可能在肿瘤发生和肿瘤进展中发挥重要作用。目前，有报道称miR-195在肝细胞癌和肾上腺皮质癌中下调，发挥肿瘤抑制的作用[14]。然而，它在乳腺癌患者血清中表达量明显上调，与乳腺癌临床分期相关[15]。因此，miR-195可能以组织特异性的方式发生在不同类型的癌症中。然而，miR-195在皮肤鳞癌中的作用还有待进一步研究。在之前的研究中，Guo等[16]报道了miR-195在NSCLC组织和细胞系中均明显下降，过表达miR-195可明显抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，研究表明在结肠癌中，miR-195 表达也明显下调[17]。本研究使用RT-qPCR方法检测miR-195在A431细胞和HaCaT细胞中的表达，发现与HaCaT细胞相比，miR-195在A431细胞中的表达量明显下调，提示miR-195的低表达可能参与了皮肤鳞癌细胞的癌变。

为了更详细地评估miR-195在皮肤鳞癌中的作用，本研究将miR-195 mimics作用于A431细胞后，发现A431细胞增殖能力明显降低，EMT能力下降，表明过表达miR-195抑制了A431细胞增殖与EMT，促进细胞凋亡。因此，miR-195可能作为抑癌基因在皮肤鳞癌发病机制中发挥作用，其具体机制及作用靶点值得进一步研究。有研究表明miR-195通过靶向WNT3A抑制结肠癌的增殖和转移[18]，靶向CHEK1调控非小细胞肺癌细胞增殖、转移及侵袭[19]。本研究通过TargetScan预测了miR-195的潜在靶基因，通过荧光素酶报告实验证实在A431细胞中MYB是候选基因。

MYB是多种癌症中的致癌基因。转录因子MYB最初被鉴定为v-MYB的细胞同源物，v-MYB是与禽类白血病相关的转化逆转录病毒癌基因。在后续研究中MYB被进一步确定为人类几种肿瘤类型中的致癌基因[20-21]。当MYB表达不当时，MYB会激活几个重要的基因靶标，如环氧合酶-2、Bcl-2和c-Myc，从而促进肿瘤的发展，影响多种过程，如增殖、侵袭和迁移。这对探索MYB在癌症发展中的调控机制尤为重要。本研究发现MYB在A431细胞中表达上调，而下调MYB明显抑制了A431细胞的增殖和转移；过表达MYB激活了细胞内PI3K-Akt信号通路。此外，miR-195可以调控A431细胞关键癌基因MYB的表达。推测miR-195参与了皮肤鳞癌发展的网络调控机制，进一步表明特异性miRNA的变化可以通过关键靶基因引起癌细胞一系列表型变化。

图5 MYB通过PI3K-Akt通路调控A431细胞的增殖和EMT 5A：Western blot检测过表达MYB对A431细胞PI3K-Akt通路的影响； 5B：p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值；5C：Western blot检测LY294002作用细胞后对PI3K磷酸水平的影响；5D：p-PI3K/PI3K比值；5E：RT-qPCR检测过表达MYB后A431细胞内MYB表达量；5F：CCK-8检测MYB通过PI3K-Akt通路对A431细胞增殖的影响； 5G：Western blot检测MYB通过PI3K-Akt通路对A431细胞内Bcl-2和Bax表达的影响； 5H：Bcl-2和Bax蛋白相对表达量；5I：Western blot检测MYB通过PI3K-Akt通路对A431细胞内E-cadherin、N-cadherin表达量的影响； 5J：E-cadherin、N-cadherin蛋白相对表达量

综上，本研究证明了miR-195表达缺失是A431细胞中的常见事件，miR-195可能通过直接靶向MYB激活PI3K-Akt通路作为肿瘤抑制因子发挥作用。该发现有助于我们更好地理解皮肤鳞癌的发病机制和发展，并可能对未来皮肤鳞癌的治疗具有重要意义。