正交试验法优选五指精蓝颗粒的提取工艺

胡 华，谭安蔷，罗宇东，李芳婵，陈惠仪

（1.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

五指精蓝颗粒由五指毛桃、人参、黄芪、绞股蓝、黄精等中药组成，方中主药五指毛桃为桑科植物粗叶榕（Ficus hirtaVahl）的干燥根，含有香豆素、黄酮、萜类等成分，具有健脾益气、行气利湿、舒筋活络的功效［1-3］；人参为五加科植物人参（Panax ginsengC.A.Mey）的干燥根和根茎，人参皂苷是其主要有效成分，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肠、生津养血、安神益智的功效［4-5］。全方配伍合用，可以扶正祛邪、补中益气。本研究参考文献［6-7］，以处方中主药五指毛桃的补骨脂素和人参的人参总皂苷为评价指标，采用正交试验法优选五指精蓝颗粒的提取工艺。

1 实验材料

1.1药材与试剂 五指毛桃、人参、黄精、绞股蓝均购自玉林药材市场，经广西中医药大学韦松基教授鉴定，五指毛桃符合《广西壮族自治区壮药质量标准（第二卷）》规定；其余药材符合《中华人民共和国药典》2015 版的规定。人参皂苷Rb1由中国科学院成都生物研究所提供（批号：MUST-18031705）；补骨脂素由中国食品药品检定研究院提供（批号：110739-201617）；高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯；其余所用试剂均为分析纯。

1.2仪器 LC2030C 3D 高效液相色谱仪（日本岛津）；752 型紫外-可见分光光度计（上海舜恒平科学仪器有限公司）；AG135型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

2 方法与结果

2.1水提工艺研究 除人参外，五指精蓝颗粒中五指毛桃、黄芪、绞股蓝、黄精等中药采用水提工艺。

2.1.1补骨脂素的含量测定［8-11］

2.1.1.1色谱条件 色谱柱：Gemini 5u C18110A（250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液（40∶60）；流速：1.0 ml/min；检测波长：245 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μl。

2.1.1.2对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素标准品适量，加甲醇配制成0.509 mg/ml的对照品溶液。

2.1.1.3供试品溶液的制备 按处方称取除人参外的五指毛桃、黄芪等药材共100 g，加8 倍量水，提取3 次，每次2 h，干燥，即得五指精蓝颗粒水提工艺的干膏。取干膏粉末约2 g，精密称定，置于三角烧瓶中，精密加入75%乙醇25 ml，称定重量，超声30 min（250 W，50 kHz），放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 ml，挥发溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.1.4缺五指毛桃阴性样品溶液的制备 按处方称取除人参、五指毛桃外的其余药材共65 g，同“2.1.1.3”项供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.1.1.5标准曲线制备 精密称取补骨脂素对照品，分别配制成浓度为0.203 6 mg/ml、0.407 2 mg/ml、0.814 4 mg/ml、1.221 6 mg/ml、1.628 8 mg/ml、2.036 mg/ml的对照品溶液，进样。以进样浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标进行线性回归，得到回归方程：Y=772 296 357X+81 492，r2=0.999 7（n=6），见图1。由此可见，补骨脂素进样浓度在0.002～0.020 mg/ml范围内与峰面积呈现线性关系良好。

图1 补骨脂素对照品标准曲线图

2.1.1.6精密度试验 取“2.1.1.5”项下浓度为0.814 4 mg/ml的对照品溶液10 μl，注入到高效液相色谱仪中，反复进样6次，分别测得峰面积为6 541 667、6 495 443、6 521 008、6 476 755、6 561 223、6 487 552，RSD=0.42%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.1.7重复性试验 取同一批样品（6 份）按“2.1.1.3”项制成供试品溶液，每个样品取10 μl分别注入高效液相色谱仪中分析，分别测得峰面积为2 895 321、2 896 358、2 978 541、2 881 369、2 906 358、3 002 116，RSD=1.73%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.1.1.8稳定性考察 取同一批样品的供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 吸取10 μl，注入到高效液相色谱仪中分析，分别测得峰面积为2 952 787、2 896 358、2 931 489、2 875 123、2 966 546、3 000 125、2 905 634，RSD=1.49%（n=7），表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.1.9加样回收率试验 取同一批已知补骨脂含量的五指精蓝颗粒水提工艺的干膏适量（共6 份），精密称定，加入等量的补骨脂标准品溶液，按照“2.1.1.3”项下方法制备加样供试品溶液，每次吸取10 μl，注入到高效液色谱仪中分析，分别测定峰面积，计算结果见表1，平均回收率为99.80%，RSD=0.20%（n=6），表明本方法测定的结果准确可信。

表1 加样回收试验结果 （n=6）

2.1.1.10样品含量测定 精密称取水提工艺干膏样品适量（10 批），按“2.1.1.3”项下方法制备成供试品溶液，每批分别精密吸取10 μl，注入到高效液相色谱仪中分析，分别测定峰面积，计算补骨脂含量，结果见表2，平均含量为1.63 mg/g，RSD=3.42%（n=10）。

表2 10批样品补骨脂含量测定结果 （n=10）

2.1.2水提工艺优化 选择加水量、提取时间、提取次数为正交设计水平因素（表3），以补骨脂素含量为指标进行提取工艺评价。按处方称取除人参外五指毛桃、黄芪、绞股蓝、黄精等药材9 份，每份100 g，按L9（34）正交表（表4）进行试验，按“2.1.1.3”项制备供试品溶液，再按“2.1.1.1”项条件测定补骨脂素含量。正交试验安排和结果见表4，方差分析结果见表5。

表3 水平因素表

表4 正交试验安排和结果

表5 方差分析结果

表4 结果显示，以补骨脂素含量为指标，加水量、提取次数、提取时间3 个影响因素极差大小顺序为：B>C>A，最佳提取工艺为A1B3C3；方差分析结果显示，提取次数对补骨脂素影响显著（P<0.05），加水量、提取时间对补骨脂素影响无显著性。综合考虑直观分析及方差分析，再结合日常生产实际，认为第2、第3次提取时间相比第1次要短，最终确定五指毛桃、黄芪等的水提工艺为：加水量8 倍，提取次数3次，提取时间分别为2 h、1 h、1 h。

2.1.3验证试验 按照处方称取五指毛桃、黄芪等药材100 g，共6份，按上述优选的提取工艺A1B3C3进行验证试验，测定补骨脂素含量分别为16.35 mg/g、16.53 mg/g、16.02 mg/g、15.96 mg/g、16.68 mg/g、15.85 mg/g，平均值为16.23 mg/g，RSD 值为2.08%（n=6），表明五指精蓝颗粒中五指毛桃等的水提工艺稳定、重现性较好。

2.2醇提工艺研究 方中人参采用乙醇提取工艺。

2.2.1人参总皂苷的含量测定［12-13］

2.2.1.1对照品溶液的制备 精密称定人参皂苷Rb1标准品适量，加甲醇配制成0.209 mg/ml 的人参皂苷Rb1对照品溶液。

2.2.1.2供试品溶液的制备 柱层析的制备：取10 ml注射器，装入D-101大孔吸附树脂（20～60目）约3 cm高，上加0.5cm中性氧化铝。将制好的柱子先用40ml 70%乙醇预洗，再用水洗，备用。取人参粉末（过四号筛），精密称取4.0 g，用80%乙醇回流3 次，每次1 h，合并回流提取药液，浓缩后定容至20 ml 容量瓶中，精密吸取样品5.0 ml，置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3 次（每次5 ml），合并萃取液，蒸干，用甲醇定容至10 ml。精密吸取0.5 ml 置于蒸发皿蒸干，皿中残渣用5 ml 10%乙醇分次溶解后上柱层析进行样品分析。先用40 ml 水洗杂质，弃去水液，再用40 ml 70%乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中水浴蒸干，用甲醇溶解皿中残渣，定容至10 ml即得。

2.2.1.3标准曲线制备 分别吸取人参皂苷Rb1对照 品 溶 液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，置于10 ml 比色管中，蒸干，分别加入0.2 ml 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 ml 高氯酸，混合摇匀，60 ℃水浴加热10 min，用水冷却2 min，分别加入5 ml冰醋酸，混匀。以除对照品溶液外的试剂作为空白，在545 nm 处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到其回归方程为：A=3.565 6C-0.008 9，r2=0.999 6（n=6）。结果表明人参皂苷Rb1溶液浓度在0.042～0.251 mg/ml 检测范围内与吸光度呈现良好的线性关系。结果见图2。

图2 人参皂苷Rb1对照品标准曲线图

2.2.1.4精密度试验 精密吸取对照品溶液0.6 ml，置于10 ml 比色管中，按照“2.2.1.3”项下方法测定，分别测得吸光度为0.455、0.439、0.448、0.452、0.450、0.445，吸光度平均值为0.448，RSD=1.25%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.1.5重复性试验 精密称取人参粉末4.0 g，共6份，按照“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每次精密吸取0.5 ml，置于10 ml 比色管中，蒸干，按照“2.2.1.3”项方法，分别测得吸光度为0.556、0.562、0.568、0.559、0.602、0.587，平均值为0.572（n=6），表明重复性良好。

2.2.1.6稳定性试验 精密称取人参粉末4.0 g，按照“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每次精密吸取0.5 ml，置于10 ml比色管中，蒸干。再按照“2.2.1.3”项方法，分别于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 进行测定，测 得 吸 光 度 为0.568、0.559、0.565、0.551、0.560、0.557，平均值为0.560，RSD=1.07%（n=6），表明供试品溶液在显色后5 h内稳定。

2.2.1.7加样回收率试验 精密吸取已知浓度的供试品溶液6 份，每份0.25 ml，精密加入0.4 ml 对照品溶液，置于10 ml比色管中，按照“2.2.1.3”项下方法分别测定吸光度，结果平均回收率为96.34%，RSD=2.47%（n=6），表明本方法测定的结果准确可信。见表6。

表6 加样回收率试验结果 （n=6）

2.2.1.8样品含量测定 精密称取3批人参样品，按2.2.1.2项方法制备供试品溶液，每批精密量取0.5 ml，按照2.2.1.3 项下方法测定吸光度，计算人参总皂苷含量为12.30 mg/g，RSD=4.85%（n=3），结果见表7。

表7 3批人参总皂苷含量测定结果 （n=3）

2.2.2醇提取工艺优化 参考人参的提取工艺文献［1-3］，选择乙醇浓度、乙醇量、提取次数、提取时间为正交设计水平因素（表8），以人参总皂苷含量为指标进行提取工艺评价。按处方精密称取人参药材（过四号筛）9 份，每份4 g，按L9（34）正交表（表9）进行试验，按“2.2.1.2”项制备供试品溶液，再按“2.2.1.3”项加入显色剂测定人参总皂苷含量。正交试验安排和结果见表9，方差分析结果见表10。

表8 水平因素表

表9 正交试验安排和结果

表10 方差分析结果

根据表9 可知，其影响因素大小依次为A>B>C>D。由表10 可知，因素A、B、C 对人参的提取有显著性影响（P<0.05），D 对提取影响不大。因此确定人参最佳提取工艺为A2B2C3D3，即最佳提取工艺：乙醇浓度80%、乙醇量8倍、提取次数3次、每次2 h。

2.2.3验证试验 精密称取人参粉末（过四号筛）6份，每份4 g，按正交优选最佳提取工艺参数进行验证试验，测定人参总皂苷分别为12.57 mg/g、12.33 mg/g、12.71 mg/g、12.18 mg/g、12.58 mg/g、12.95 mg/g，平均含量为12.55 mg/g，RSD=2.17%（n=6），试验结果表明人参提取工艺稳定可行、重复性好。

3 讨 论

五指毛桃在岭南民间广泛应用，我们通过配伍人参等药材开发出的五指精蓝颗粒，组方新颖、效果确切、使用方便［14-16］。五指精蓝颗粒组方药材中，大部分药材的有效成分是水溶性成分，但人参中的皂苷类成分是醇溶性成分，为了更好地保证提取出有效成分，所以选择了水和乙醇两种提取溶剂对药材进行分别提取。五指毛桃、绞股蓝等药材中的有效成分可溶于热水，所以选择了水作为提取溶剂，补骨脂素作为方中主药五指毛桃的有效成分，可以较好地反映水提工艺的效率。人参中的皂苷类成分易溶于甲醇、乙醇等溶剂，当首选毒性小、使用广泛的乙醇来作为人参的提取溶剂。由于皂苷与芳香醛一硫酸或高氯酸的显色反应在可见区能获得稳定的特征吸收峰，因此通过比色定量可以测定总皂苷的含量。目前较常用的显色方法有高氯酸法、香草醛-冰醋酸-高氯酸法和茴香醛-浓硫酸法。经预试验，香草醛-冰醋酸-高氯酸显色方法最大波长明显，反应相对稳定。因此，本研究以人参皂苷Rb1为指标，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色方法，采用紫外-可见分光光度法对人参总皂苷进行含量测定。

本实验通过对主药五指毛桃及贵重药人参不同的提取工艺考察验证，采用正交试验法优选出最佳工艺，筛选出水溶性成分提取工艺为：加水量8 倍，提取次数3 次，提取时间分别为2 h、1 h、1 h；醇提工艺为：乙醇浓度80%、乙醇量8 倍、提取次数3 次，每次2 h。通过验证试验，表明筛选出的工艺稳定可行、重复性好，可为五指精蓝颗粒进一步开发应用提供理论依据。