氢氧化钠-尿素水溶液高温处理对桉木枝桠材纤维酶解性能的影响

2021-01-08张学金周小凡

中国造纸 2020年12期

翟睿张学金周小凡

（1.浙江科技学院浙江省废弃生物质循环利用与生态处理技术重点实验室，浙江杭州，310023；2.南京林业大学江苏省制浆造纸重点实验室，江苏南京，210037）

化石能源属不可再生资源[1]，在使用过程中所生成的燃烧产物会造成大气污染，因此对可再生绿色能源的开发以及利用，并用该类能源替代化石能源这一方向受到了国内外学者的关注。在该背景下，对生物乙醇这一可再生绿色能源的研发和利用受到了广泛关注[2]。

在早期的研发过程中，人们主要以面粉、大米以及玉米等粮食资源作为原料制备生物乙醇，但目前多以农业废弃物（如稻草秸秆、麦草秸秆）作为替代物，具体的流程包括原料预处理、生物酶解、酶解液的发酵以及发酵产物的提纯等[3-4]，其中原料预处理的作用最为关键，因此如何提高原料预处理效率这一课题受到了广泛关注[5]。

农业废弃物属于低利用率资源，而在制浆造纸工业中，木材原料的枝材同样属于低利用率资源（树干为高利用率资源），但相关研究表明，枝材的制浆性能和干材大致相当，可用于制浆的生产[6]，此外树干纤维可用于生物乙醇的制备，因此可以推测，枝材纤维也可起到类似的作用。

氢氧化钠-尿素水溶液是在低温条件下溶解纤维素纤维制备纤维素材料的溶剂[7]，但利用该溶剂处理枝材纤维进而改善其生物酶解性能这一方向鲜有报道。依前期探索，笔者发现氢氧化钠-尿素水溶液可有效改善木质纤维素纤维的酶解性能[8-9]，原因在于：在低碱浓和低用碱量的条件下，氢氧化钠可以实现纤维无定形区的部分润胀进而使纤维得到软化，在纤维润胀度增加的同时，尿素可进一步软化纤维（分子中的氨基可起到上述作用），随着纤维润胀度和软化度的提高，其反应活性得到改善，这有利于纤维化学组分在预处理过程中的脱除；在预处理过程中，随着温度的升高，氢氧化钠对木质素的脱除能力增强，同时尿素在氢氧根存在的环境下可部分水解而转化为氨，这有利于木质素发生氨解而促进其脱除，而木质素可屏蔽碳水化合物和生物酶的有效接触进而降低酶解效率；此外笔者还发现碱脲体系中氢氧化钠-硫脲-尿素水溶液的处理效果最好，但硫脲在预处理过程中容易生成含硫的污染物质。鉴于上述分析，本研究利用氢氧化钠-尿素水溶液在高温条件下处理桉木枝材纤维以求改善其生物酶解性能，用单因素实验探究最佳处理工艺，考察了该溶剂的处理效果。

1 实验

1.1 实验原料和试剂

1.1.1 实验原料的准备

取足量去皮桉树枝材木片（产自广东），用温水浸泡洗涤以除去其中灰尘等杂质，随后浓缩至20%的浓度，用磨浆机将其磨解成粗浆并经充分筛选后得到细浆，收集全部细浆，离心脱水后搓散并室温风干（该风干浆简称“原纤维”），待水分平衡后测定固含量备用。

1.1.2 实验药品的准备

将氢氧化钠、尿素和去离子水按6∶4∶90 的质量比[10]混合均匀并制成水溶液，密封静置保存以稳定浓度。

分别将纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶用pH值=4.8 的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解完全并按标准方法测定各自的酶活，完成后按1∶1.2∶1（纤维素酶∶木聚糖酶∶纤维二糖酶）的酶活比[11]将3 种酶溶液混合，调节混合液的酶活（以纤维素酶的酶活计）为20 FPU/mL，于4℃条件下静置密封保存。

1.2 实验方法

1.2.1 原纤维的组分含量检测

取适量原纤维，用纤维粉碎机粉碎，筛选后取40～60 目的组分，按国家标准测定苯-醇抽出物含量（GB/T 10741—2008）、木质素（酸不溶和酸溶木质素含量测定分别参照GB/T 747—2003 和GB/T 10337—2008，将酸不溶木质素含量和酸溶木质素含量相加得到总木质素含量）和综纤维素（测定参照GB/T 2677.10—1995）的百分含量。取检测木质素含量时得到的硫酸水解液，用高效液相色谱检测其中葡萄糖、木糖和甘露糖的绝对含量并折算成占原料绝干质量的百分比（简称“含量”），将单糖含量换算成相应的聚糖含量并相加得到原纤维中的总糖含量[12]。

1.2.2 原纤维的化学预处理

取一定量的原纤维置于蒸煮罐中，加入氢氧化钠-尿素水溶液，用清水调至液比1∶4 并加入蒽醌，将蒸煮罐置于蒸煮器中，空转15 min 使药液浸渍完全，随后按2℃/min 的速率升至最高温并保温一段时间使反应完全，完成后将纤维洗净，离心脱水后搓散并称量，记为处理后纤维，平衡水分后测定固含量以计算预处理得率。

1.2.3 处理后纤维的组分含量分析

取适量处理后纤维，室温风干，将纤维粉碎筛选后取40～60 目间的组分，用同样的方法测定其中苯-醇抽出物、木质素和综纤维素的百分含量，其脱除率的计算见公式（1）。

式中，M表示原纤维中组分含量；M′表示处理后纤维中的组分含量，d表示预处理得率。

1.2.4 处理后纤维的酶解性能分析

将处理后纤维中大于60 目的粉末再次筛选并取大于100目的组分，平衡水分后测定固含量，随后取相当于2 g 绝干质量的粉末于100 mL 碘量瓶中，加入混合酶溶液（混合酶的用量为10 FPU/g底物，以纤维素酶的酶活计），补充醋酸-醋酸钠缓冲溶液至5%的酶解浓度，加入适量四环素以防止微生物污染，将碘量瓶密封后在150 r/min和50℃的条件下振荡72 h，随后将酶解液在沸水浴中灭活，将得到的悬浮液真空抽滤并用热水洗涤滤饼以收集全部单糖，抽滤液经蒸发浓缩后用高效液相色谱检测其中单糖含量，再将单糖含量折算成相应的聚糖含量，将聚糖含量相加后得到处理后纤维中的酶解总糖含量并计算总糖转化率，经综合分析后确定最佳工艺条件。糖含量的计算方法如下。

（1）原纤维中六碳聚糖质量=硫酸水解液中六碳单糖质量×0.9；原纤维中五碳聚糖质量=硫酸水解液中五碳单糖质量×0.88；原纤维中六碳聚糖含量=原纤维中六碳聚糖质量/用于测定木质素含量的原纤维的绝干质量×100%；原纤维中五碳聚糖含量=原纤维中五碳聚糖质量/用于测定木质素含量的原纤维的绝干质量×100%；

（2）被酶解的六碳聚糖质量=酶解液中六碳单糖质量×0.9；被酶解的五碳聚糖质量=酶解液中五碳单糖质量×0.88；被酶解的六碳聚糖含量=被酶解的六碳聚糖质量/和用于酶解的处理后纤维质量相对应的原纤维的绝干质量（该质量=用于酶解的处理后纤维粉末的绝干质量/处理得率，本研究中，用于酶解的处理后纤维粉末的绝干质量恒定为2 g）×100%；被酶解的五碳聚糖含量=被酶解的五碳聚糖质量/和用于酶解的处理后纤维质量相对应的原纤维的绝干质量×100%；总糖转化率=酶解总糖含量/原纤维总糖含量×100%。

1.2.5 氢氧化钠-尿素水溶液处理效率评价

用清水替代氢氧化钠-尿素水溶液，在上述最佳工艺条件下处理原纤维，完成后用同样的方法检测上述所有性能指标并作为空白值，考察氢氧化钠-尿素水溶液的处理效果。

2 结果与讨论

2.1 原纤维组分含量分析

原纤维组分含量如表1所示。

表1 原纤维化学组分含量分析 %

由表1 可知，原纤维中的总糖含量低于综纤维素含量，这是由于阔叶木半纤维素中含有糖醛酸基和甲氧基，这些基团易在硫酸水解过程中从半纤维素的主链上脱落，同时酸水解过程中会有部分单糖转化为糠醛类物质[13]，而糖醛酸类物质、甲氧基类物质和糠醛类物质无法被高效液相色谱检出，因此总糖含量低于综纤维素含量。

2.2 用碱量的影响

用碱量对纤维化学组分含量的影响如表2 所示，用碱量对纤维化学组分脱除率的影响如图1所示。

表2 用碱量对纤维化学组分含量的影响 %

图1 用碱量对纤维化学组分脱除率的影响

由表2 和图1 可知，随着用碱量的增加（处理温度145℃，保温时间40 min），苯-醇抽出物和木质素的含量降低，综纤维素含量增加，同时3种组分的脱除率随用碱量的增加而增加。

苯-醇抽出物、木质素、纤维素和半纤维素均属于碱溶性物质，用碱量越高，混合体系中的碱浓越高，而碱浓越高，组分越容易被脱除，所以4种组分的脱除率均增加；综纤维素含量反映纤维素含量和半纤维素含量的总和，因此综纤维素的脱除率增加。随着脱除率的增加，更多的苯-醇抽出物和木质素得以有效降解，这也使得处理后纤维中这两种物质的含量降低；纤维素和半纤维素也属碱溶性物质，但化学反应活性远不如苯-醇抽出物或木质素高，这也是处理过程中存在组分选择性脱除的主要原因。因此综纤维素的脱除率比苯-醇抽出物或木质素低很多[14]，即处理后纤维中纤维素和半纤维素的绝对含量（质量）逐渐降低，但其百分含量增加，从而使综纤维素的含量随着用碱量的增加而增加。

用碱量对纤维酶解性能的影响如表3 所示。由表3 可知，随着用碱量的增加（处理温度145℃，保温时间40 min），处理后纤维中被酶解的葡聚糖以及木聚糖和甘露聚糖的含量增加，但当用碱量高于11%时，被酶解的聚糖含量降低。

表3 用碱量对纤维酶解性能的影响 %

在较低用碱量的条件下，由于碱溶液对木质素脱除的选择性较好，纤维素和半纤维素等碳水化合物没有显著降解，这也保证了处理后纤维中可发生酶解的聚糖含量不受明显影响；同时碱溶液几乎全部消耗于苯-醇抽出物和木质素的降解以及纤维的润胀，由于部分木质素和苯-醇抽出物存在于纤维表面，对碳水化合物起阻隔作用，即木质素的脱除有利于促进碳水化合物与酶溶液的有效接触；此外氢氧化钠-尿素水溶液对纤维的润胀能力强，而纤维润胀度越高，其体积越大，这利于酶溶液对纤维的浸透以及进一步促进碳水化合物与酶溶液的接触和纤维酶解性能的改善，纤维酶解性能越好，被酶解的聚糖含量越高[15]，因此被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量增加。

在高用碱量的条件下，碱溶液对木质素脱除的选择性变差，碳水化合物在木质素被大量脱除的同时会发生更为明显的降解，处理后纤维中可酶解的总糖质量显著降低，这也导致被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖含量的降低。综上，选择11%的用碱量作为后续研究基准。

2.3 处理温度的影响

处理温度对纤维化学组分含量的影响如表4所示，处理温度对纤维化学组分脱除率的影响如图2所示。

由表4 和图2 可知，随着处理温度的增加（用碱量11%，保温时间40 min），苯-醇抽出物和木质素的含量降低，综纤维素含量增加，同时3种组分的脱除率随处理温度的增加而增加。

表4 处理温度对纤维化学组分含量的影响

图2 处理温度对纤维化学组分脱除率的影响

反应温度越高，化学反应速率越大，纤维化学组分越容易被脱除，苯-醇抽出物、木质素、纤维素和半纤维素的降解程度越高，脱除率越大。随着脱除率的增加，苯-醇抽出物和木质素的含量降低，由于纤维素和半纤维素的化学反应活性不如苯-醇抽出物或木质素高，因此这两种物质的脱除率低，这也导致综纤维素的含量增加。

处理温度对纤维酶解性能的影响如表5 所示。由表5 可知，随着处理温度的增加（用碱量11%，保温时间40 min），处理后纤维中被酶解的葡聚糖以及木聚糖和甘露聚糖的含量增加，但当处理温度高于140℃时，被酶解的聚糖含量降低。

表5 处理温度对纤维酶解性能的影响

处理温度越高，越有利于苯-醇抽出物和木质素的脱除，进而增加暴露于纤维表面的碳水化合物的含量并促进其与生物酶的接触以及酶解的进行；同时随着处理温度的提高，纤维的润胀度提高，有利于酶溶液对纤维的浸透，这同样促进了纤维酶解性能的改善，因此处理后纤维中被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量随着处理温度的增加而增加。但当处理温度过高时，碳水化合物的水解反应变得剧烈（较低温度的条件下仅发生剥皮反应而不能发生水解反应），纤维素和半纤维素的脱除率增加，处理后纤维中可酶解聚糖的质量显著降低，这不利于生物酶解的进行，因此处理后纤维中被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量降低。综上，选择140℃的处理温度作为后续研究基准。

2.4 保温时间的影响

保温时间对纤维化学组分含量的影响如表6 所示，保温时间对纤维化学组分脱除率的影响如图3所示。

表6 保温时间对纤维化学组分含量的影响

图3 保温时间对纤维化学组分脱除率的影响

由表6 和图3 可知，随着保温时间的增加（用碱量11%，处理温度140℃），处理后纤维中苯-醇抽出物和木质素的含量降低，综纤维素含量增加，同时3种组分的脱除率随保温时间的增加而增加。

木材原料中木质素的大量脱除需要在高温条件下进行（蒸煮时一般要求处理温度高于150℃），此外组分脱除和纤维润胀均非瞬间或短时间内完成，因此保温在木材原料的化学蒸煮过程中不可缺失。本研究所用枝材纤维属木材原料，尽管酶解前的化学预处理对木质素脱除率的要求低于化学浆蒸煮的要求，但仍要求木质素得到明显的脱除，因此保温操作在本研究中予以采用。随着保温时间的增加，纤维化学组分得到脱除，苯-醇抽出物、木质素和综纤维素的脱除率增加，处理后纤维中苯-醇抽出物和木质素的含量降低，由于纤维素和半纤维素化学反应活性低，综纤维素含量增加。

表7 为保温时间对纤维酶解性能的影响。由表7可知，随着保温时间的增加（用碱量11%，处理温度140℃），葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量增加，但当保温时间长于50 min时，被酶解的聚糖含量降低。

原料中的木质素组分在升温阶段的脱除比例相对较低，因此需要借助最高温条件下的保温过程方可实现明显的脱除。随着保温时间的增加，木质素的脱除率逐渐增加，暴露于处理后纤维表面的碳水化合物的含量增加，同时纤维润胀度和体积增加，这利于改善纤维与生物酶的接触效率以及纤维酶解性能的改善，因此处理后纤维中被酶解的葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖以及酶解总糖含量增加。保温时间过长时，碱溶液对木质素脱除的选择性变差，此时碳水化合物的降解比例增加，处理后纤维中可酶解聚糖含量显著降低，进而导致处理后纤维中被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的含量降低。综上，选择50 min的保温时间作为最佳工艺条件。

表7 保温时间对纤维酶解性能的影响

表8 纤维化学组分含量和纤维酶解性能分析 %

2.5 纤维化学组分含量和纤维酶解性能分析

经热水处理后的纤维（WF，处理温度140℃，保温时间50 min，浸渍时间15 min、液比1∶4）和经氢氧化钠-尿素水溶液处理后的纤维（SUF，用碱量11%，处理温度140℃，保温时间50 min，浸渍时间15 min、液比1∶4）的组分含量和酶解性能如表8所示。

由表8 可知，经氢氧化钠-尿素水溶液处理后纤维中苯-醇抽出物和木质素含量与经热水处理后纤维相比降幅明显，同时被酶解的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖含量以及酶解总糖的含量和总糖转化率显著增加。其总糖含量为50.9%，总糖转化率为81.18%。这表明氢氧化钠-尿素水溶液可有效脱除原料中的苯-醇抽出物和木质素等组分，使更多的纤维素和半纤维素组分暴露于纤维表面，此外该溶剂可以润胀纤维，增加纤维的体积，促进纤维和酶溶液的有效接触，进而改善纤维的酶解性能。