表面活性剂改善高固体系木质纤维素酶水解的研究

谷 丞 霍 丹 韩 潇 陈 辉 杨秋林 李 霖 薛鹏程 司传领 裴继诚

（天津科技大学轻工科学与工程学院，天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457）

木质纤维素是植物光合作用形成的天然高分子有机复合物，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。因其价格低廉，来源广泛、且可生物降解等特点，是生产第三代燃料乙醇最理想的原料。

木质纤维素生物炼制生产燃料乙醇过程通常包括预处理、水解、发酵、蒸馏等单元操作。其中纤维素水解为可发酵糖是纤维素乙醇炼制过程中至关重要的环节。一直以来关于木质纤维原料酶水解的报道主要集中在基于木质纤维原料物理化学结构和纤维素酶两方面。木质纤维素原料本身的结构特点决定了其与纤维素酶的结合有一定限制，包括纤维素的聚合度[1]、结晶度[2]、颗粒粒径[3]、对纤维素酶的可及性[4-5]、保水值[6]以及底物中半纤维素和木质素等非纤维物质对纤维素酶的无效吸附等[7]；对纤维素酶的研究主要侧重于酶活性的提高、成本的降低等方面[8]。然而，以上研究都是在低浓条件下、即底物浓度在2%或以内完成的。在木质纤维素制备燃料乙醇的工业生产中，为满足后续蒸馏过程经济性要求即降低发酵产物的蒸馏能耗、提高设备的利用率、节约酶水解用水、减少废水治理成本等，蒸馏浓缩后乙醇浓度必须不少于4%，即酶水解后葡萄糖浓度至少达到8%。因此，酶水解反应的底物浓度至少为20%才能满足上述对酶水解液中葡萄糖含量的要求。然而，有研究表明，在底物浓度高于10%时纤维素原料不能完全有效转化，一次加料上限为12% ～15%[9]。可能是因为随着底物含量增加，终产物和抑制物相应增多，浆料黏度增大，底物得不到有效搅拌导致酶不能与其充分接触，高浓度的抑制作用逐渐增强，纤维素转化率随之下降[10]。为改善高固体系木质纤维素酶水解的流变性能，多采用表面活性剂对高固体系流变性能进行改性[11]。

木质素磺酸钠是一种阴离子表面活性剂，由于磺酸的离子化而带负电荷，其相对分子质量介于200～10000 之间，是纸浆生产的副产品。在木质纤维素的酶解过程中，木质素磺酸钠可以吸附在木质素表面并形成空间位阻和水合膜，从而可降低纤维素酶对木质素的非生产性吸收，进一步增强木质纤维素的酶水解效率[12]。

本研究将木质素磺酸钠引入到高固体系的纤维素酶水解中，考察木质素磺酸钠加入量对酶水解的影响，并将木质素磺酸钠与其他类型的表面活性剂复配，改善高固体系的流变性和纤维素酶的假性吸附，进一步提高纤维素酶水解效率。

1 实 验

1.1 实验材料

桉木片，购自广西金桂纸业；将桉木片用植物粉碎机磨粉后取40～60目，平衡水分后备用。纤维素酶（C2730）和纤维二糖酶（C6105），生物试剂，均购自Sigma-Aldrich公司；木质素磺酸钠，分析纯，购自国药集团；其他化学药品均为分析纯。

1.2 酶水解固体基质的制备

桉木粉预处理条件为：氯化镁浓度0.2 mol/L，固液比1∶10，温度170℃，保温时间20 min。反应所得预处理固体用去离子水洗涤至中性，并平衡水分，其中纤维素、半纤维素、木质素含量分别为：58.20%、4.33%和34.21%。

1.3 纤维素酶水解

准确称取已预处理的10.00 g（±0.1 g）绝干桉木粉，置于250 mL锥形瓶中，加入一定量的0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 值为4.8），配成底物浓度为10%（w/V）的悬浮液，并加入不同量的表面活性剂。然后向反应体系中加入纤维素酶（15 FBU/g）及纤维二糖酶（18.75 CBU/g），并加入1 滴乙酸乙酯，用于防止水解过程中微生物及杂菌的产生。将上述样品放置于恒温培养振荡器中，于50℃下反应72 h，期间振荡器的转速保持在150 r/min。反应结束后，将反应物在90℃水浴中加热10 min，对纤维素酶进行灭活处理。酶解混合物经真空过滤后得酶解液及固体残渣。

对酶解液中的还原糖含量进行测定，其中酶解过程中的还原糖转化率（酶水解效率）计算见式（1）。

式中，YRSc为酶水解效率，%；mRS为酶水解液中还原糖质量，mg；mc0为生物质中纤维素的绝干质量，mg；n为稀释倍数；C为水解液中的还原糖含量，mg/mL；V为水解液体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 木质素磺酸钠对纤维素酶水解的影响

2.1.1 木质素磺酸钠加入量对酶水解效率的影响

图1 为木质素磺酸钠加入量对酶水解效率的影响。如图1所示，随着底物中木质素磺酸钠加入量的增加，酶水解效率呈现先增加后降低的趋势，但都较未添加木质素磺酸钠样品有所提高。当木质素磺酸钠加入量为0.4%时（相对于固体底物质量），酶水解效率为93.72%，相对于未加入木质素磺酸钠时提高了12.5个百分点。说明微量木质素磺酸钠的加入提高了高固体系的酶水解效率。MgCl2预处理固体中仍然含有大量的木质素，而负电性极强的木质素磺酸钠会吸附到固体基质中残存的木质素表面，从而降低了纤维素酶在木质素上可能会发生的“无效吸附”，提高酶水解效率[13]。由于木质素磺酸钠中的带负电的磺酸基团可与纤维素酶中带正电的氨基结合，在酶水解体系中木质素磺酸钠的加入可与纤维素酶（Cel）形成木质素磺酸钠（LS）-纤维素酶聚集体（LCCs），从而可稳定纤维素与纤维素酶间的链接。但若木质素磺酸钠加入量过高或木质磺酸盐的磺化度过高，带的负电荷过高，产生的高负电荷的LCCs 聚集体则与带负电的纤维素之间产生强烈的静电斥力，从而减少纤维素与纤维素酶的结合位点的数量。因此，当木质素磺酸钠加入量过大时，酶水解效率反而略有降低。

图1 木质素磺酸钠加入量对酶水解效率的影响

2.1.2 木质素磺酸钠对不同反应时间下酶水解效率的影响

酶水解时间是影响葡萄糖得率的重要因素。木质素磺酸钠的加入是否会缩短酶水解的时间需要做进一步验证。图2为木质素磺酸钠对不同反应时间下酶水解效率的影响。

图2 木质素磺酸钠对不同反应时间下酶水解效率的影响

由图2可知，反应时间在0～48 h时，随着反应时间的延长，酶水解效率快速增长，当反应48 h时，酶水解效率达到最高值。超过48 h，酶水解效率有所下降。主要是由于反应时间过长，水解液中的葡萄糖重新吸附到固体底物中，以及过高浓度葡萄糖的聚集抑制了酶水解反应的进行。因此，最佳的酶水解时间为48 h，即木质素磺酸钠的加入不会缩短酶水解的时间，但会大大提高葡萄糖的得率，从而提高纤维素酶的水解效率。

2.1.3 木质素磺酸钠对不同pH 值下酶水解效率的影响

pH值是纤维素酶水解的关键影响因素，图3为木质素磺酸钠对不同pH值下纤维素酶水解效率的影响。

图3 木质素磺酸钠对不同pH值下酶水解效率的影响

由图3 可知，随着酶解体系pH 值的增加，酶解效率呈现先增加后降低的趋势。当pH值为5.0时，酶解体系的转化效率最高，达到95.26%，较未添加样提高了9.03%。当pH 值高于5.0 时，酶水解效率反而有所降低。因此，最佳的酶水解pH 值为5.0。相同pH 值下，添加0.4%木质素磺酸钠，可提高纤维素的酶水解效率，最高可提高10.4个百分点。

2.1.4 木质素磺酸钠对不同底物浓度下酶水解效率的影响

酶水解固体底物浓度越高，水解液中葡萄糖的浓度就会相应增加，从而可降低后续发酵的成本。然而底物浓度越高，体系流变性会相应降低，从而酶与底物中纤维素的接触点可能会降低、体系中聚集的过量葡萄糖也会对酶水解产生抑制作用，因此在现有条件下控制底物浓度是达到最大转化率的关键。本实验设定反应体系pH 值5.0、木质素磺酸钠加入量0.4%、反应72 h，反应温度50℃，考察木质素磺酸钠对不同浓度固体底物酶水解的影响，结果见图4。

如图4 可知，随着酶水解体系中底物浓度的增加，酶水解效率是逐渐降低的，未添加木质素磺酸钠的酶水解体系降低的尤为明显。这与体系流变特性以及聚集的葡萄糖量过多有关。同时，与未添加木质素磺酸钠的相比，随着底物浓度的提高，添加木质素磺酸钠可显著提高纤维素的酶水解效率，如当底物浓度为17%时，添加木质素磺酸钠可将酶水解转化率提高13.0个百分点。可能与木质素磺酸钠可提高高浓度体系的流变性有关。

图4 木质素磺酸钠对不同底物浓度下酶水解效率的影响

2.2 木质素磺酸钠与其他类型表面活性剂复配对酶水解效率的影响

通过上述2.1 中的分析，木质素磺酸钠作为一种阴离子性表面活性剂，对MgCl2预处理固体基质的高固体系酶水解有明显的促进作用。但当pH 值较低时，木质素由于羧基离子的作用而带负电荷，木质磺酸盐也带负电荷，两者之间存在静电斥力，从而进一步降低了木质磺酸盐对木质素的吸附。同时，木质磺酸盐形成的空间位阻不足以有效降低纤维素酶对木质素的无效吸附。因此，笔者考察了木质素磺酸钠与阳离子表面活性剂（十六烷基三甲基溴化铵，CTAB）和非离子表面活性剂（吐温80）复配对改善高固体系的酶水解效率的作用效果。

2.2.1 木质素磺酸钠与阳离子表面活性剂复配

为考察CTAB 与木质素磺酸钠复配对酶水解的影响，本实验在反应体系中加入相同量（0.4%）的木质素磺酸钠，并按照m(CTAB)∶m(LS)=0.05∶1～3∶1的比例加入CTAB，酶解反应体系的pH 值5.0，反应时间48 h，底物浓度10%，反应温度50℃，研究表面活性剂复配对酶水解效率的影响。

图5 为CTAB 与木质素磺酸钠质量比对纤维素酶水解效率的影响。由图5可知，当木质素磺酸钠的加入量一定，随着CTAB 加入量的提高，酶水解效率逐渐增加。当CTAB 的加入量相对于木质素磺酸钠为0～0.5时，酶水解效率迅速增加，当m(CTAB)∶m(LS)为0.7∶1～1.5∶1时，酶水解效率增加较平缓；当m(CTAB)∶m(LS)为1.5∶1时，酶水解效率最高为99.56%，即酶水解体系中的固体基质中的纤维素基本全部转化为还原糖。再增加CTAB 的相对加入量，酶水解效率略有降低。总体而言，阳离子表面活性剂CTAB 的加入，可明显提高酶水解效率。

图5 CTAB与木质素磺酸钠的质量比对酶水解效率的影响

2.2.2 木质素磺酸钠与非离子表面活性剂复配

为考察吐温80 与木质素磺酸钠复配对酶水解的影响，在反应体系中加入相同量（0.4%）的木质素磺酸钠，并按照质量比m(吐温80)∶m(LS)=0.05∶1～1.5∶1加入吐温80，酶解反应体系的pH 值5.0，反应时间48 h，底物浓度10%，反应温度50℃，研究表面活性剂复配对酶解效率的影响。

图6为吐温80与木质素磺酸钠的质量比对纤维素酶水解效率的影响。由图6可知，当木质素磺酸钠的加入量一定，随着吐温80 加入量的提高，酶水解效率逐渐增加。当吐温80 的加入量相对木质素磺酸钠为0～0.2时，酶水解效率迅速增加，当吐温80的加入量相对木质素磺酸钠为0.3～1 时，酶水解效率增加平缓，当m(吐温80)∶m(LS)为1∶1 时，酶水解效率最高为99.98%，即酶水解体系中的固体基质中的纤维素基本全部转化为还原糖。再增加吐温80 的相对加入量，酶水解效率略有降低。总体而言，吐温80 的加入，可明显提高酶水解效率。

图6 吐温80与木质素磺酸钠的质量比对酶水解效率的影响

3 结 论

本研究以木质素磺酸钠为主要助剂，考察其对经金属氯盐预处理的桉木粉在高固体系纤维素酶水解中的影响。

3.1 木质素磺酸钠作为阴离子表面活性剂，可促进高浓度固体基质的流动性，防止纤维素酶与底物中木质素的“无效吸附”，可显著提高高固体系纤维素酶水解的效率，降低生产成本。

3.2 在酶水解体系中添加0.4%的木质素磺酸钠，酶水解效率可达93.72%，比未添加样品提高了12.50%；并且底物浓度越大，木质素磺酸钠对酶水解效率的优化作用越大，当底物浓度为17%时，添加木质素磺酸钠，可将酶水解效率提高13.0个百分点。

3.3 将木质素磺酸钠分别与CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和吐温80 两种表面活性剂复配，结果表明，表面活性剂复配对高固体系的纤维素酶水解效率均有协同促进作用；当m(CTAB)∶m(木质素磺酸钠)为1.5∶1时，酶水解效率可达99.56%；当m(吐温80)∶m(木质素磺酸钠)为1∶1 时，酶水解效率为99.98%，纤维素基本可完全水解为还原糖。