丹参酮ⅡA 对尾吊大鼠发生废用性骨质疏松症防治作用的研究

王 玺,李 凯,冯康虎,高玉海,陈克明*

(1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.甘肃省中医院,甘肃 兰州 730000;3.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院骨科研究所,甘肃 兰州 730000)

废用性骨质疏松症是由于骨骼承受的机械力减少,导致骨量局部或全身性减少而引起的一种继发性骨质疏松症。一般见于脑出血、心肌梗死等需要长期卧床的病人或脊髓损伤,骨折后肢体活动障碍的患者以及长期太空飞行的相关工作人员。资料显示,人的机体在长期卧床或失重的状态下骨质疏松症的发生率可达81%,而骨折的发生率则高达为39%[1]。这些患者通常还伴随有肾结石、关节周围的异位骨化、病理性骨折等多种并发症[2],因此越来越受到人们的重视。

废用性骨质疏松症的患者往往有疼痛、肢体乏力、失运等症状及体征,属于中医的“骨痹” “骨痿” 病。中医认为本病是以肾虚、脾虚、肝虚为本,气滞血瘀为标的本虚表实之症,因此具有补肾、健脾、活血等功效的中药成为中医药防治废用性骨质疏松症的首选药物[3]。丹参是常见的活血化瘀药物之一,具有“活血调经,祛瘀止痛,养血安神” 等功效[4],而丹参酮ⅡA作为丹参有效成分之一,它不仅具有温和的雌激素样活性[5],而且可以改善微循环,舒张血管,抗炎及清除自由基等多种生物学效应[6],所以近年来丹参酮ⅡA在防治骨质疏松症方面一直被寄予厚望。解放军第九四〇医院骨研所课题组经过前期实验研究发现了丹参酮ⅡA可以对抗去卵巢大鼠所致的骨质疏松症[7],提高生长期大鼠的峰值骨量[8],它是否可以用来防治废用性骨质疏松症,值得我们关注。因此本课题通过尾部悬吊的方法,建立废用性骨质疏松大鼠模型,早期给予丹参酮ⅡA进行灌胃干预,通过检测大鼠骨代谢的变化,初步探讨丹参酮ⅡA对废用性骨质疏松的防治作用,为废用性骨质疏松症的防治提供实验依据,也为今后的临床应用奠定一定的基础。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雌性2 月龄wistar 大鼠30 只,体质量为(175.83±1.33) g,购于甘肃中医药大学实验动物中心,许可证号:SCXK (甘) 2015-0005。

1.2 试剂及药物 丹参酮ⅡA(陕西宝鸡辰光生物科技有限公司,质量分数≥98%,批号HT034210198)；盐酸四环素(东京化成工业株式会社,日本)；钙黄绿素(Sigma-Aldrich 公司,日本)；水合氯醛(天津大茂化学试剂公司,中国)；血清骨钙素试剂盒(IDS 公司,英国)；抗酒石酸酸性磷酸酶5b 试剂盒(IDS 公司,英国)。

1.3 仪器 双能X 线骨密度仪(Prodigy,美国GE 公司),正置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司),万能材料试验机(AG-IS,日本岛津公司),硬组织切片机(SP1600,德国LEICA 公司) 等。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药 将2 月龄SPF 级雌性wistar大鼠适应性饲养1 周,利用随机区组法分为对照组、尾吊组、丹参酮ⅡA组,每组10 只。尾吊组和丹参酮ⅡA组大鼠建立尾吊模型:分别用75% 的酒精搽涂大鼠尾部表面,去除油脂和皮屑,自需尾吊大鼠一侧尾根部起,按纵向走行,将适宜长度和宽度的医用透气胶带粘贴于尾部表面距尾尖部3～5 cm 远,接着在粘贴胶带的部位,放置钢丝环,再一次轻轻加绕胶带2～3 圈,固定钢丝环。用尾吊笼子里的铁环挂钩将钢丝环锁定,通过调节铁链的高低来维持大鼠头部始终处于低位,使大鼠身体的纵轴与水平倾斜呈30°角,恰好可使大鼠的后爪在伸直位时不触及笼子的底部,即使大白鼠后肢始终处于悬空不负重的状态,但前肢可着地自由活动,可正常觅食饮水。

2.2 操作方法 大鼠在中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院SPF 级动物实验中心饲养。尾吊模型建立后,将丹参酮ⅡA在研钵内研磨后配置成悬浊液,然后给丹参酮ⅡA组大鼠按11 mg/kg 给药灌胃,对照组及尾吊组则给予等量的蒸馏水灌胃,灌胃后造模组大鼠均继续维持后肢悬空状态。各组大鼠于每天同一时间开始给药灌胃,连续4 周,每天1 次,实验期间密切观察大鼠生理反应和生活习性的变化,注意尾吊情况、皮毛色泽、鼠尾血循环,每7 d 测量体质量1 次。所有大鼠在第14、15 天皮下注射四环素,剂量为20 mg/kg；处死前第3、4 天皮下注射钙黄绿素,剂量为10 mg/kg。各组大鼠均于4 周后处理,处理前均进行体质量测定,用10%水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉采血后处死,抽抗凝血约3 mL,室温下静置10 min 后,3 000 r/min离心5 min,用移液枪吸取血清,保存于-80 ℃冰箱内待检。取双侧股骨、胫骨,腰椎,用生理盐水湿纱布包裹后放入密封袋中,存入-20 ℃冰箱保存,待测量前自然解冻。

2.3 指标测定

2.3.1 实验动物生活习性的观察和体质量的测定 实验期间密切观察大鼠生理、生活习性的变化,维持悬吊,注意皮毛色泽、鼠尾血循环的改变,防止悬吊脱落或断尾情况。每周测量大鼠体质量1 次。

2.3.2 骨密度测定 将右侧胫骨、腰椎自然解冻后,置于双能X 线骨密度仪下,分别检测离体骨密度。

2.3.3 骨生物力学性能测定 应用万能材料试验机,分别进行股骨三点弯曲试验及椎体压缩试验。①三点弯曲试验时,将冻存的右股骨自然解冻后置于AG-IS 生物力学万能试验机上,跨距14 mm,加载速度10 mm/min,计算机记录载荷变形曲线及最大载荷、弹性模量；②压缩试验时,将椎骨自然解冻,分离第四腰椎椎体,用剪刀小心剪除椎间盘,并用砂纸打磨上下两端至平行,将磨制好的椎体置于试验机上,以2 mm/min 的加载速度进行压缩,测量最大载荷、弹性模量。

2.3.4 骨代谢生化指标测定 检测骨钙素(OC)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP 5b),均采用英国IDS 公司生产的试剂盒。按说明制作各自标准曲线,计算样品中OC、TRACP 5b 水平,单位分别为ng/mL、U/L。

2.3.5 骨形态计量学测定 将冻存的椎体自然解冻后分离第5 腰椎,将其保存于70%酒精中,包埋前将第5 腰椎体进行酒精脱水,二甲苯透明后采用不脱钙塑料包埋法包埋。将包埋好的骨组织置于SP1600 硬组织切片机切片,厚度为30 μm,先后用1 000～2 000 的砂纸进行打磨,先在显微镜下进行双荧光标记观察并拍照,再经VG 染色,在显微镜下观察染色结果并拍照。图片采用IPP6.0 图片分析软件,进行骨形态计量学分析。

2.3.6 椎体的HE 染色及成骨细胞计数 将冻存的椎体自然解冻后分离第3 腰椎,将其放于4% 多聚甲醛中固定24 h,然后在10% EDTA 溶液中脱钙4 周,平行于椎板,将椎体切成两半,并进行石蜡包埋,获得4 μm 厚的切片,将其固定在聚赖氨酸处理的抗脱落载玻片上,脱蜡,苏木精-伊红(HE) 染色,然后在光学显微镜下观察。成骨细胞的密度通过IPP6.0 图片分析软件,对椎骨骨膜表面单位视野中的梭形成骨细胞进行计数统计。

2.3.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件处理,计量资料以() 表示,数据通过正态检验后,不同组间比较采用单因素方差分析,方差齐则组间两两比较采用LSD,若方差不齐则采用Games-Howell 法。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量变化结果 实验期间各组大鼠饮食正常,体质量均有所增长。尾吊一定程度上影响了大鼠的体质量,但各组间差异无统计学意义(P＞0.05),说明尾吊模型及药物处理对其生长无明显影响(见图1)。

图1 各组大鼠体质量

3.2 离体骨密度检测结果 尾吊组胫骨、椎体离体骨密度与对照组相比均减低(P＜0.01),说明尾吊的建立可以导致大鼠骨量的流失；丹参酮ⅡA组与尾吊组相比其骨密度有所升高,有统计学意义(P＜0.05),说明丹参酮ⅡA对尾吊大鼠骨密度有一定的提升作用,如表1 所示。

表1 各组大鼠胫骨和椎体离体骨密度比较（，n=10）

表1 各组大鼠胫骨和椎体离体骨密度比较（，n=10）

注:与尾吊组比较,◆P＜0.05。

3.3 股骨三点弯曲和椎体压缩实验结果 与对照组相比,尾吊组的股骨和椎体的最大载荷、弹性模量均下降(P＜0.01)；丹参酮ⅡA组的股骨和椎体的最大载荷值与尾吊组相比均有所升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；股骨及椎体的弹性模量与尾吊组相比也有所增高,差异有统计学意义(P＜0.05),说明尾吊后大鼠股骨及椎体的骨密度均有所下降,丹参酮ⅡA可以对抗骨量的丢失,如表2、3所示。

表2 各组大鼠股骨生物力学指标比较（，n=10）

表2 各组大鼠股骨生物力学指标比较（，n=10）

注:与尾吊组比较,◆P＜0.05。

表3 各组大鼠椎体生物力学指标比较（，n=10）

表3 各组大鼠椎体生物力学指标比较（，n=10）

注:与尾吊组比较,◆P＜0.05。

3.4 大鼠血清生化指标结果 与对照组相比,尾吊组的血清OC 指标降低(P＜0.01),而丹参酮ⅡA组与尾吊组比,OC 值有所升高,差异有统计学意义(P＜0.01),说明丹参酮ⅡA可以促进成骨细胞分泌OC,从而促进骨的形成；与对照组相比,尾吊组血清TRACP 5b 指标有所增加,统计学有差异 (P ＜0.01),而丹参酮ⅡA组与尾吊组相比,TRACP 5b 指标有所降低,差异有统计学意义(P＜0.05),说明丹参酮ⅡA一定程度上可以抑制破骨细胞分泌TRACP 5b,如图2 所示。

图2 血清生化指标比较

3.5 骨形态计量学结果

3.5.1 椎体VG 染色结果 如图3 所示,椎体骨组织呈红色,椎体内红色网状结构为骨小梁；尾吊组和丹参酮ⅡA组与对照组相比,其骨小梁结构均比较稀疏,数量也较少,骨小梁的分离度略有增加。如图4 所示,与对照组相比,尾吊组的骨小梁的数目、厚度均明显减少,骨小梁分离程度明显增加,差异均有明显统计学意义(P＜0.01)；丹参酮ⅡA组与尾吊组相比,骨小梁数量及厚度均有所增加(P＜0.01,P＜0.05),分离度也有所改善(P＜0.05)。

图3 椎体VG 染色比较（×40）

图4 椎体骨小梁微结构指标比较

3.5.2 椎体荧光标记结果 如图5 所示,与对照组相比,尾吊组及丹参酮ⅡA组的双荧光标记间的距离均较小。如图6 所示,与对照组相比,尾吊组的双荧光间距减小,差异有统计学意义(P＜0.01)；丹参酮ⅡA组与尾吊组相比,双荧光间距有所增加,差异有统计学意义(P＜0.05),说明丹参酮ⅡA在一定程度上促进了椎体骨量的增殖。

图5 椎体双荧光标记比较（×100）

图6 椎体双荧光标记间距量化值比较

3.6 大鼠椎体HE 染色结果 如图7 所示,椎体骨组织呈粉红色,椎体骨组织骨膜附近黑色梭形细胞为成骨细胞；与对照组相比,尾吊组成骨细胞均比较稀疏,数量较少,细胞质也不饱满。如图8 所示,与对照组相比,尾吊组成骨细胞数目明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01)；丹参酮ⅡA组与尾吊组相比,其成骨细胞的数目有所增加(P＜0.01),说明丹参酮ⅡA在一定程度上可以保护成骨细胞,减轻其凋亡。

图7 椎体HE 染色比较（×40）

图8 椎体成骨细胞计数比较

4 讨论

中医药治疗各种疾病有数千年的历史,因为其疗效可靠,副作用小,广泛被人们所接受。中医认为“痹有瘀血”,因此血瘀是废用性骨质疏松症的病因之一。《黄帝内经·素问·宣明五气篇》曰“久卧伤气”,而“气为血之帅”,气行则血行,气止则血止,气滞血瘀则骨髓失养,发为“骨痿”。尾吊模型的建立模拟了患者“久卧” 的病理状态。丹参是祖国医学中经典的活血化瘀药物之一,具有活血补血的功效,丹参酮ⅡA又是其主要的活性成分之一。丹参酮ⅡA可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化,增加碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白-2、Runx2 等的表达[9-10],通过抑制 NF-κB、PI3-kinase/Akt 和 MAPK 途 径,减 弱RANKL 诱导的破骨细胞生成[11],通过抑制破骨细胞分泌前列腺素E2来抑制骨的吸收[12]。因此,本实验以丹参酮ⅡA为实验药物,参考前期课题组的灌胃剂量11 mg/kg[8],来研究它对尾吊大鼠发生废用性骨质疏松症的防治作用。

尾吊模型是通过大鼠肢体的废用和失重而建立的一种废用性骨质疏松模型,因为其造模方式引起的全身应激反应最小[13],即使尾吊期间应用1,25-二羟基维生素D、生长素、膳食钙、阿伦磷酸盐和肌肉刺激等,也不能完全纠正骨骼由于卸载而导致的生长抑制,因此尾吊大鼠模型可用于研究卸载对骨骼的生理作用及细胞机制,也是目前国际公认的失重条件下对骨代谢进行研究的较为适宜动物模型[14]。本次实验结果显示,尾吊导致大鼠下肢及椎体骨量的流失,离体骨密度及骨生物力学均出现明显下降；血清中的骨代谢指标提示,尾吊大鼠的骨形成减弱,骨吸收增强；通过对椎体骨组织形态的测量,分别从静态和动态的组织学参数中进一步了解到尾吊大鼠椎体骨结构出现了明显退变；椎体HE 染色也可见骨组织中成骨细胞数量明显减少。

骨密度的测量对骨质疏松症的诊断、治疗及随访均有重要的意义。本研究通过对大鼠右侧胫骨及椎体的离体骨密度进行检测后发现,丹参酮ⅡA组大鼠的骨密度有了一定的改善,明确了丹参酮ⅡA对卸载导致的骨质疏松有一定防治作用。

骨生物力学是通过机械试验的方法来测量骨骼的强度和刚度,可以了解骨骼的力学性能及骨密度状况[15]。实验中股骨三点弯曲试验及椎体压缩试验结果都表明了丹参酮ⅡA组大鼠股骨及椎体的最大载荷、弹性模量均有明显提高。说明丹参酮ⅡA可以改善骨骼的强度和韧性,减少骨折的发生。

OC 是公认的反映骨形成敏感而特异的指标,往往可以提示新生成骨细胞的活性,与骨组织形成的指标成正比,而TRACP 5b 则是由破骨细胞发生骨吸收时释放的,因此它可以同时反映了破骨细胞的活性及骨吸收的状况。通过对大鼠血清结果的分析,我们发现丹参酮ⅡA促进了新生成骨细胞的活性,增加了OC 的分泌,加快了骨组织的生长增殖。同时我们也看到丹参酮ⅡA在一定程度上抑制了破骨细胞的活性,从而减少了TRACP 5b 的分泌,阻止骨的吸收。由此可见丹丹参酮ⅡA是通过双向调节来维持尾吊大鼠骨量,对抗骨量丢失的。

骨组织的VG 染色及双荧光标记,可以使我们分别从静态和动态的组织学参数中进一步了解骨微观结构的变化[16]。实验中丹参酮ⅡA组的骨小梁的数目、厚度明显增加,骨小梁也较密集；丹参酮ⅡA组的双荧光间距也高于尾吊组。这些说明丹参酮ⅡA不仅在一定程度上抑制了骨量吸收,还可促进骨组织的增殖。

骨组织切片的HE 染色可以清楚观察到骨组织中成骨细胞的数量和形态,是一种经典的染色方法。实验中我们观察到丹参酮ⅡA减轻了椎体骨组织中成骨细胞的凋亡,使成骨细胞的数量增多,细胞形态更加饱满。

综上所述,丹参酮ⅡA改善了尾吊模型建立的废用性骨质疏松大鼠的骨密度和骨质量,这表明它对废用性骨质疏松有一定的防治作用,但是由于其脂溶性高、生物利用度低和半衰期短等缺点[17],也给临床的应用带来了一定的困难,因此需要我们进一步深入研究它对骨代谢影响的作用机制,对其结构进行适当的改造修饰,改善它的理化性质及药动学特点,进一步挖掘它对废用性骨质疏松症的防治潜能。