苏合香挥发油对脑缺血再灌注诱导神经细胞损伤的影响

陈 雨 林高城白 亮

(1.福建中医药大学附属康复医院神经康复二科,福建 福州 350003;2.福建省康复技术重点实验室,福建福州 350031)

中风是由脑血管破裂或血管阻塞引起的一种脑损伤,每年在世界上内可造成4 400 万人残疾[1]。其中,缺血性中风会导致认知功能障碍和神经功能缺损[2],目前有效减少梗塞面积的溶栓术是其主要治疗方法[3],但在恢复血液灌注后,缺血性脑组织中经常会发生不可逆的脑缺血再灌注损伤,严重限制了缺血性中风患者的康复。

苏合香是金缕梅科植物苏合香树Liquidimibar orientalis Mill.的树干渗出的香树脂经加工精制而成的中药,具有开窍、辟秽、止痛的功效,用于治疗中风痰厥、猝然昏倒、胸痹心痛、胸腹冷痛、惊痫[4],挥发油是其重要药效成分之一,对颈动脉结扎的不完全性脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定保护作用,够减轻氧化应激损伤和抑制脑细胞凋亡[5],但该药材在糖氧剥夺/再复氧诱导的脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制尚不清楚。Toll 样受体9 (TLR9)是TLR 家族成员之一,已被证实在脑梗死大鼠中的表达明显上调,参与脑梗死后的组织修复和炎症损伤过程[6]。本实验以体外培养的大鼠皮层神经细胞为对象,利用糖氧剥夺/再复氧建立脑缺血再灌注损伤模型,以研究苏合香挥发油对其神经细胞增殖、凋亡、氧化应激的影响,通过TLR9探索其潜在分子机制,为相关治疗剂提供参考。

1 材料

SD 大鼠[出生1～2 d,动物生产许可证号SCXK (沪)2014-0003]购自上海斯莱克实验动物有限公司。苏合香购自亳州清逸中药材有限公司。神经元培养基(Neurobasal-A medium) 购自美国Gibco 公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (caspase-3)、兔抗TLR9、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) 一抗购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA) 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 苏合香挥发油制备 参照文献[7]报道,水蒸气蒸馏法提取50 g 药材的挥发油,无水硫酸钠干燥后,得到浅黄色透明油状物(收油率为0.25%)。

2.2 细胞培养与处理 大鼠皮层神经细胞的分离培养参照王凯华[8]报道的方法进行。细胞贴壁后在神经元培养基中培养,生长环境为37 ℃、5% CO2,将培养6～7 d 的神经细胞分为正常对照组、模型组(神经细胞通过OGD/R 模拟脑缺血再灌注损伤) 及10、20、40 μg/mL 苏合香挥发油组(挥发油和脑缺血再灌注处理神经细胞)[9]。其中,脑缺血再灌注损伤根据周转利[10]的报道,采用物理缺氧方法,以无糖神经元培养基代替原有培养基,将细胞于含1%O2、94%N2、5%CO2的三气培养箱中进行OGD 处理1 h,之后更换为正常神经元培养液再复氧24 h。苏合香挥发油作用时间为24 h。

2.3 细胞转染与处理 si-TLR9、si-TLR9 的阴性对照si-NC、pcDNA3.1-TLR9,以及pcDNA3.1-TLR9 的阴性对照pcDNA3.1 均由上海GenePharma 公司合成。将神经细胞(2×104个) 接种于6 孔板,当其融合至70% 时根据Lipofectamine 2000 试剂说明书指示,通过si-TLR9、pcDNA3.1-TLR9 进行转染,转染后的细胞分为si-NC 组、si-TLR9 组、40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1 组、40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1-TLR9 组,均进行脑缺血再灌注处理。转染24 h 后收集细胞,评价其脑缺血再灌注损伤的影响。

2.4 细胞存活检测 采用CCK-8 法。将神经细胞(5×104/孔) 接种到96 孔板上,经“2.3” 项下方法处理后加入20 μL CCK-8 溶液,于37 ℃、5% CO2环境中孵育,1 h后通过酶标仪在450 nm 波长处读取每孔吸光度。

2.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。收集神经细胞(1×106个),195 μL 含FITC-annexin V 的结合缓冲液重悬,加入5 μL Annexin V-FITC,混匀,10 μL PI 染色液混匀,于黑暗、室温下孵育,30 min 后置于流式细胞仪上检测细胞凋亡。

2.6 caspase-3、TLR9 蛋白表达检测 采用Western blot法。RIPA 裂解缓冲液裂解各组神经细胞后,等量(20 μg)蛋白加到上样缓冲液中后沸水变性10 min,在8%～12%十二烷基硫酸钠(SDS) -聚丙烯酰胺凝胶(PAGE) 电泳凝胶上分离,电转移到聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂牛奶封闭印迹并过夜,将聚偏二氟乙烯膜与一抗孵育2 h,与二抗孵育1 h,其中caspase-3、TLR9 蛋白一抗以1∶1 000 比例稀释,对照GAPDH 以1∶2 000 比例稀释,二抗以1∶5 000 比例稀释。孵育结束后,通过增强型化学发光液对结合抗体进行可视化,Quantity One 软件分析caspase-3、TLR9 蛋白条带。

2.7 SOD 活性、MDA 水平检测 采用试剂盒法。收集各组神经细胞,按照检测试剂盒说明书操作检测SOD 活性、MDA 水平。

2.8 TLR9 mRNA 表达检测 采用qPCR 法。收集各组神经细胞,磷酸盐缓冲液洗涤后加入TRIzol 试剂分离细胞总RNA,cDNA 的合成通过Prime Script RT 试剂盒进行,再根据制造商说明,通过SYBR Green Master Mix 试剂盒在ABI 7500 PCR 仪进行qPCR 反应。TLR9 引物序列为正向5′-CCAGTTTGTCAGAGGGAGCC-3′,反向 5′-GGACAGGTGGACGAAGTCAG-3′；内参GAPDH 引物序列为正向5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,反 向 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′,通过2-ΔΔCt法计算TLR9 mRNA 表达。

2.9 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理,数据以() 表示,组间比较采用单因素方差分析、t 检验、SNK-q 检验,P＜0.05 表示差异具有有统计学意义。

3 结果

3.1 苏合香挥发油对脑缺血再灌注损伤的影响 图1、表1 显示,与正常对照组比较,模型组神经细胞存活率降低(P＜0.05),凋亡率、caspase-3 蛋白表达升高(P＜0.05)；与模型组比较,各剂量苏合香挥发油组神经细胞存活率升高(P ＜0.05),凋亡率、caspase-3 蛋白表达降低 (P ＜0.05),并呈浓度依赖性。

图1 苏合香挥发油对脑缺血再灌注损伤模型凋亡（A） 及caspase-3 蛋白表达（B） 的影响

表1 苏合香挥发油对脑缺血再灌注损伤的影响（，n=9）

表1 苏合香挥发油对脑缺血再灌注损伤的影响（，n=9）

注:与正常对照组比较,*P＜0.05；与模型组比较,#P＜0.05。

3.2 苏合香挥发油对SOD 活性、MDA 水平的影响 表2显示,与正常对照组比较,模型组SOD 活性降低(P ＜0.05),MDA 水平升高(P＜0.05)；与模型组比较,各剂量苏合香挥发油组SOD 活性升高(P＜0.05),MDA 水平降低(P＜0.05),并呈浓度依赖性。

3.3 苏合香挥发油对TLR9 表达的影响 图2、表3 显示,与正常对照组比较,模型组TLR9 mRNA 及蛋白表达升高(P＜0.05)；与模型组比较,各剂量苏合香挥发油组TLR9mRNA 及TLR9 蛋白表达降低 (P ＜0.05),并呈浓度依赖性。

表2 苏合香挥发油对SOD 活性、MDA 水平的影响（，n=9）

表2 苏合香挥发油对SOD 活性、MDA 水平的影响（，n=9）

注:与正常对照组比较,*P＜0.05；与模型组比较,#P＜0.05。

图2 各组TLR9 蛋白表达

表3 苏合香挥发油对TLR9 表达的影响（，n=9）

表3 苏合香挥发油对TLR9 表达的影响（，n=9）

注:与正常对照组比较,*P＜0.05；与模型组比较,#P＜0.05。

3.4 抑制TLR9 对脑缺血再灌注损伤及SOD 活性、MDA 水平的影响 图3、表4 显示,与si-NC 组比较,si-TLR9 组TLR9 和caspase-3 蛋白表达、凋亡率、MDA 水平降低(P＜0.05),存活率、SOD 活性升高(P＜0.05)。

3.5 过表达TLR9 对脑缺血再灌注损伤的影响 图4、表5显示,与40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1 组比较,40 μg/mL 苏合香 挥发油+pcDNA3.1-TLR9 组 TLR9 和caspase-3 蛋白表达、凋亡率升高(P＜0.05),细胞存活率降低(P＜0.05)。

3.6 过表达TLR9 对SOD 活性、MDA 水平的影响 表6 显示,与40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1 组比较,40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1-TLR9 组SOD 活性降低(P＜0.05),MDA 水平升高(P＜0.05)。

图3 抑制TLR9 对TLR9 （A）、caspase-3 （B） 蛋白表达的影响

表4 抑制TLR9 对脑缺血再灌注损伤及SOD 活性、MDA 水平的影响（，n=9）

表4 抑制TLR9 对脑缺血再灌注损伤及SOD 活性、MDA 水平的影响（，n=9）

注:与si-NC 组比较,*P＜0.05。

图4 过表达TLR9 对TLR9 （A）、caspase-3 （B） 蛋白表达的影响

4 讨论

目前,对缺血性中风的治疗方法主要包括手术和药物,其中神经保护剂是特异性治疗的主要方法[11],但脑缺血再灌注损伤机制复杂,涉及多种信号途径和生物学过程[12]。本实验探讨了苏合香挥发油在改善脑缺血再灌注损伤中的生物学功能,并初步研究了其潜在的分子机制,发现该成分可通过减轻氧化应激损伤来发挥神经保护作用,可能通过下调TLR9 表达来有效抑制氧化应激,表明苏合香有望成为相关新型天然药物。

表5 过表达TLR9 对脑缺血再灌注损伤的影响（，n=9）

表5 过表达TLR9 对脑缺血再灌注损伤的影响（，n=9）

注:与40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1 组比较,*P＜0.05。

表6 过表达TLR9 对SOD 活性、MDA 水平的影响（，n=9）

注:与40 μg/mL 苏合香挥发油+pcDNA3.1 组比较,*P＜0.05。

苏合香具有多种生物活性,如醒脑开窍、抗心肌缺血抗血栓、抗血小板凝聚等[13],其挥发油含安息香酸、苯甲醇、α-松油醇等成分[7]。前期报道,在颈动脉结扎诱导的脑缺血再灌注损伤大鼠中,苏合香挥发油可引起脑组织较低的MDA 水平、细胞凋亡率,以及较高的SOD 活性,通过减轻氧化应激损伤来起到保护效果[14]；提高二亚硫酸钠导致PC12 细胞活性,保护缺血缺氧PC12 细胞损伤[9]；本实验发现,该成分可明显提高脑缺血再灌注损伤的神经细胞存活率,显著降低凋亡率、caspase-3 蛋白表达,并呈现浓度依赖性。

脑组织易受自由基破坏,氧化应激在脑缺血再灌注损伤的发病机理中起着重要作用[15]。研究表明,缺氧/氧自由基会介导过度的ROS 生成和氧化应激,导致神经和胶质细胞死亡[16-17],神经组织由于耗氧量、多不饱和脂肪酸含有量高,抗氧化能力相对较低,导致容易受到氧化攻击[17],而苏合香挥发油可通过抑制氧化应激来发挥显著的神经保护作用。在苏合香挥发油处理后的脑缺血再灌注损伤模型中,抗氧化酶SOD 活性明显升高,脂质过氧化中产物MDA 水平显著减少,并呈浓度依赖性,表现了较强的抗氧化能力,与前期报道[14]相符。另外,在发生脑缺血再灌注损伤时,苏合香挥发油减轻氧化应激是神经细胞促增殖和抗凋亡的原因,有助于神经功能的恢复。

不同质量浓度苏合香挥发油可显著降低脑缺血再灌注损伤神经细胞中TLR9 mRNA、TLR9 蛋白表达,并呈浓度依赖性,可能与调控TLR9 表达有关。TLR9 在脑梗死早期大鼠的炎症过程中发挥了重要作用[18]；在缺血性急性肾损伤中它促进细胞损伤和凋亡,加剧缺血性急性肾损伤[19]；在非酒精性脂肪性肝炎中其表达上调,缺失时对肝细胞损伤具有一定的保护作用[20]；本实验发现,抑制TLR9 时可明显增加脑缺血再灌注损伤的神经细胞存活率和SOD 活性,显著减少凋亡率、caspase-3 蛋白表达、MDA 水平,表明抑制TLR9 可通过提高脑缺血再灌注损伤细胞增殖,减轻氧化应激、抑制细胞凋亡来产生保护效果。另外,过表达TLR9 能减弱苏合香挥发油对脑缺血再灌注损伤神经细胞存活、SOD 活性的促进作用,以及对细胞凋亡率、caspase-3 蛋白表达、MDA 水平的抑制作用,表明该成分可能是通过抑制TLR9 表达来实现对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

综上所述,苏合香挥发油可促进脑缺血再灌注损伤神经细胞增殖,抑制细胞凋亡,减轻氧化应激,表现出神经保护活性,其作用机制可能与下调TLR9 表达有关,可为该药材在相关治疗方面的潜力提供了新证据。