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鹅不食草中抗肺癌活性成分筛选及异戊酸心菊内酯单体的体外作用研究

2021-01-08薛鹏辉于弘王敏赵新春邱峰周光飚

中成药 2020年12期
关键词:戊酸内酯抗癌

胡 倩 薛鹏辉于 弘王 敏赵新春邱 峰周光飚*

(1.北京中医药大学中药学院,北京 102488;2.国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室,北京 100021;3.中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室,北京 100101;4.天津中医药大学中药学院,天津 301617)

鹅不食草Centipeda minima (L.) A.Br.et Aschers.是菊科植物,分布广泛,药用历史悠久,为常用中药材,其气微香,久嗅有刺激感,味苦、微辛,性温,归肺经,具有发散风寒、通鼻窍、止咳功效,适用于风寒头痛、咳嗽痰多、鼻塞不通、鼻渊流涕等症状,具有抗炎、抗菌、抗过敏、神经保护作用[1-5]。课题组前期报道了鹅不食草单体的抗癌作用[6],并首次发现从中提取的化合物6-氧-当归酰多梗白菜菊素在细胞、动物模型均显示显著的抗肺癌活性,其机理是和蛋白泛素连接酶E3 复合物(Skp1-Cullins-F-box E3,SCF E3) 的基本成分细胞周期S 期激酶相关蛋白1 (S-phase kinase associated protein,Skp1) 及具有促癌活性的信号传导与转录激活因子3 (signal transduction and activators of transcription 3,STAT3) 结合,导致促癌性E3连接酶间变性淋巴瘤激酶核相互作用伴侣(nuclear-interacting partner of anaplastic lymphoma kinase,NIPA)、S 期激酶相关蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2,Skp2)、β-转导重复相容蛋白 (beta transducinrepeats containingproteins,β-TRCP) 从Skp1 解离而降解失活,而STAT3 活性受抑制使Skp2 活性进一步受抑制,引起肺癌细胞周期阻滞在有丝分裂期[7-8]。为了解鹅不食草是否还含有其他活性较强的抗肺癌物质,本实验体外检测了32 个单体化合物抗肺癌细胞活性,以期为该药材相关作用的进一步开发奠定基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 32 种鹅不食草单体化合物(CM-1~CM-32) 由天津中医药大学邱峰教授实验室提供,纯度均达99%以上。RPMI-1640、DMEM培养基购自美国Gilbco 公司;胎牛血清购自美国Hyclone 公 司;噻唑蓝 [3-(4,5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT]、二甲基亚砜 (DMSO) 购自美国Amresco 公司;Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;抗Cleaved caspase-3、caspase-8、PARP、ERK、p-ERK(Thr202/Tyr204)、AKT、p-AKT (Ser473)、NFκB 抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司;抗β-Actin 抗体、脱脂奶粉均购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器 酶标仪(美国BioTek 公司);倒置相差荧光显微镜(日本Olympus 公司);CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific 公司);流式细胞仪(美国BD 公司);蛋白电泳仪及湿式蛋白电转系统(上海天能科技有限公司);脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.3 细胞 肺癌细胞均购自美国ATCC 细胞库,在37 ℃、含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养。其中,A549 用加入10%胎牛血清的DMEM 培养基培 养,NCI-H1975、NCI-H1299、NCI-H460、NCIH520 用加入10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养。

2 方法

2.1 化合物配制 32 种鹅不食草单体化合物均溶于DMSO,配成浓度为20 mmol/L 的母液,保存于-20 ℃。使用时稀释并加入到细胞培养基,调整至化合物终浓度为1~20 μmol/L。

2.2 MTT 法检测细胞存活率 取对数生长期细胞,胰酶消化细胞计数后,调整细胞密度至5×104个/mL,用96 孔板铺板,每孔加入100 μL 细胞悬液;待细胞完全贴壁后换上含有相应药物浓度梯度的新鲜培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。测前3 h 加10 μL MTT 溶液,用酶标仪测定570 nm 波长处吸光度值并计算细胞存活率及半数抑制浓度(IC50)[9]。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 消化要检测的细胞(每个样品约1.5×105个细胞),PBS 洗2 遍,每次用1 000 g 离心5 min 后去上清,收集细胞,加入195 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞,每个样品加入3 μL FITC-Annexin V 染料轻轻混匀,室温避光孵育10~20 min,随后置于冰浴上,孵育过程中可以重悬细胞2~3 次以改善染色效果。上机前加入5 μL 溴化乙啶染料,通过流式细胞仪检测凋亡的肺癌细胞比例。

2.4 免疫印迹 取等量蛋白样品于12% SDSPAGE 胶上样,先80 V 恒压电泳15 min,待样品跑至分离胶再将电泳电压调高至120 V,待样品迁移到目的位置后,结束电泳。湿法转膜后,加入含5% 脱脂奶粉的TBS-T 液体中室温封闭1 h。按1∶1 000的比例加入一抗稀释液,室温孵育3 h,4 ℃过夜。第2 天,孵育二抗、洗膜、显影。

3 结果

3.1 32 个鹅不食草单体化合物对肺癌细胞系的抑制作用 用浓度为20 μmol/L 的32 种鹅不食草单体化合物(CM-1~CM-32) 分别处理非小细胞肺癌细胞株H460、A549,48 h 后行MTT 实验分析其对肺癌细胞增殖的抑制作用。在32 种鹅不食草单体中有10 种(31.3%) 能使这2 种细胞株的增殖活性减少15%以上,它们分别是CM-5、CM-6、CM-8、CM-13、CM-16、CM-19 (阿里二醇)、CM-20、CM-25 (6-氧-当归酰多梗白菜菊素)、CM-26 (异戊酸心菊内酯)、CM-28 (图1、表1)。

图1 32 种鹅不食草单体成分对肺癌细胞增殖活性的影响(,n=3)Fig.1 Effects of thirty-two compounds on lung cancer cell viability (,n=3)

3.2 抗肺癌活性较强的化合物 3 个化合物阿里二醇、6-氧-当归酰多梗白菜菊素、异戊酸心菊内酯在20 μmol/L 的浓度下对A549、H460 细胞系具有显著的抑制作用,对细胞增殖活性的抑制率达到70%以上(图1)。于是进一步研究了这3 个化合物的抗肺癌作用。在不同浓度梯度下,这3 个化合物对 5 种肺癌 细胞株 H460、A549、H1975、H1299、H520 的增殖均表现出较强的抑制作用,且呈剂量依赖性,IC50均为μmol/L 级,而6-氧-当归酰多梗白菜菊素、异戊酸心菊内酯的作用较强,对H460、A549、H1975、H1299 细胞株的IC50在2.74~8.59 μmol/L 之间,而对H520 的IC50分别为11.68、20.66 μmol/L (表2)。

3.3 异戊酸心菊内酯对H1975、H1299 细胞的凋亡诱导作用 由于异戊酸心菊内酯具有较强的抑制肺癌细胞增殖的作用(表2),于是进一步研究其凋亡诱导作用。用浓度为5、7.5 μmol/L 的异戊酸心菊内酯处理H1975 细胞48 h,可使60%和80%的细胞发生凋亡 (图2)。用浓度为2.5、5、7.5 μmol/L的异戊酸心菊内酯同样处理H1299 细胞,发生凋亡的细胞比例分别为15%、66.5%、84% (图3)。

3.4 异戊酸心菊内酯对凋亡蛋白的影响 半胱氨酸蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase) 家族是细胞凋亡的“执行者”,Caspase-3在细胞凋亡过程中发挥主要作用,其活化后对底物PARP (poly ADP-ribose polymerase) 的剪切被认为是细胞凋亡的一个重要依据。caspase-8 在外源凋亡途径中发挥重要作用。结果显示,加药24 h 后,异戊酸心菊内酯引起了H1975、H1299 细胞中PARP 的剪切并产生降解片段,同时caspase-3、caspase-8 也出现剪切活化片段(图4),说明异戊酸心菊内酯可诱导肺癌细胞发生凋亡。

表1 从鹅不食草中分离的10 个单体化合物Tab.1 Ten compounds isolated from C.minima

表2 阿里二醇、6-O-当归酰多梗白菜菊素、异戊酸心菊内酯对不同肺癌细胞系的IC50值(μmol/L,,n=3)Tab.2 The IC50 values of arnidiol,6-O-angeloylplenolin,and helenalin-isovalerate for non-small cell lung cancer cell lines(μmol/L,,n=3)

表2 阿里二醇、6-O-当归酰多梗白菜菊素、异戊酸心菊内酯对不同肺癌细胞系的IC50值(μmol/L,,n=3)Tab.2 The IC50 values of arnidiol,6-O-angeloylplenolin,and helenalin-isovalerate for non-small cell lung cancer cell lines(μmol/L,,n=3)

3.5 异戊酸心菊内酯对H1975 细胞增殖相关蛋白p-ERK、p-AKT 及核转录因子NF-κB 的影响 众多研究表明,p-ERK (phospho-extracellular regulated protein kinases,细胞外调节蛋白激酶)、p-AKT(phospho-protein kinase B,蛋白激酶B) 在肿瘤细胞中高度表达,并且它的表达与肿瘤细胞增殖密切相关。NF-κB (nuclear factor kappa-B) 是一种核转录因子,存在广泛,作为许多重要细胞的中央调节剂,在功能上,NF-κB 能调控大量先天性和适应性免疫反应过程,在细胞增殖、凋亡、炎症及肿瘤的发生中扮演了重要角色。本研究发现(图5),加药24 h 后,异戊酸心菊内酯使H1975 细胞中p-ERK、p-AKT 蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性,而H1975 细胞中ERK、AKT 蛋白的本底表达水平没有显著变化。同样加药24 h 后,可见NF-κB 蛋白表达水平与对照组相比降低。说明异戊酸心菊内酯发挥抗肿瘤的作用可能与抑制p-ERK、p-AKT 及NF-κB 的表达有关。

图3 异戊酸心菊内酯对H1299 细胞的凋亡诱导作用(,n=3)Fig.3 Helenalin-isovalerate induced H1299 cells apoptosis (,n=3)

图4 异戊酸心菊内酯对凋亡相关蛋白的影响(,n=3)Fig.4 Effect of helenalin-isovalerate on the apoptosis-related proteins

图5 异戊酸心菊内酯对H1975 细胞增殖相关蛋白的影响(,n=3)Fig.5 Effect of helenalin-isovalerate on the proliferation-related proteins in H1975 cells (,n=3)

4 讨论

肺癌已成为全世界发病率最高、致死人数最多的恶性肿瘤,全球每年相关死亡人数达180 万[10],在我国就有63.1 万[11]。目前,肺癌的西医治疗手段主要包括手术、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等,取得一定效果,但非小细胞肺癌、小细胞肺癌的5 年生存率分别只有19%、6%[12],故研发有效的相关新型药物是医学界重要研究课题。我国拥有丰富的中药资源,对其应用和研究有着悠久的历史,开发抗肺癌相关药物具有重要的临床意义。

鹅不食草主要化学成分包括黄酮、萜类、挥发油、酚类、酚酸等[13-16]。本实验所筛选出的3 种活性较好的化合物中,CM-19 为阿里二醇,关于其抗癌活性的研究很少,值得将来深入研究其作用及机理;CM-25 为6-氧-当归酰多梗白菜菊素,是第1种Skp1 抑制剂,对STAT3 也有一定抑制作用,可导致癌蛋白NIPA、Skp2、β-TRCP 发生降解而对抑癌蛋白F 框/WD40 域蛋白基因(F-box and WD-40 domain-containing protein 7,FBXW7) 无作用,并在细胞与动物模型显示较强的抗癌作用,包括抗非小细胞肺癌[7-8]、多发性骨髓瘤等[17];CM-26 为异戊酸心菊内酯,它是倍半萜类化合物,对其活性的研究极少,但发现心菊内酯可抑制NF-κB 表达,继而引起细胞自噬性死亡[18],或通过抑制NF-κB、促进反应性氧类产生而逆转B 细胞淋巴瘤-2 (Bcell lymphoma 2,Bcl-2) 介导的凋亡抵抗[19]。本实验发现,异戊酸心菊内酯可抑制肺癌细胞增殖,诱导caspase-3 依赖性的细胞凋亡,其作用机制可能与抑制了p-ERK、p-AKT、NF-κB 蛋白表达有关,表明鹅不食草含有多种抗癌物质,单体化合物的活性及其机理并不相同,它们联合作用才能呈现总体抗癌活性。

鹅不食草作为一种传统中药,虽为2020 年版《中国药典》 收录,但其抗癌活性在临床上未被检测过。因此,结合前期研究结果[7-8,17-19],本实验认为有必要开展鹅不食草用于肺癌等恶性肿瘤治疗的临床试验,可单独使用,也可与其他药物联用,以明确该药材是否具有抗癌的临床用途,并为相关治疗提供新选择。

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