基于HPLC 图谱探究苗药八爪金龙3 个基原不同药用部位的差异*

王长彬 ，周永强 ，俸婷婷 ，雷传文 ，周 英

（贵州中医药大学 a.药学院；b.药食两用资源应用与开发研究中心；c.中药材开发技术研究中心，贵州 贵阳550025）

八爪金龙为紫金牛科紫金牛属植物，具清热解毒，活血止痛、祛风除湿的功能，用于咽喉肿痛、扁桃体炎、跌打损伤、风湿痹痛，为贵州省少数民族用药，也被苗族奉为喉科良药。八爪金龙主要有3 个基原，为朱砂根Ardisia crenata Sims、百两金[Ardisia crispa（Thunb.）A.DC.]和红凉伞[Ardisia crenata Sims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen]的干燥根及根茎[1,2]。目前，苗药八爪金龙的发展存在着较多问题：（1）朱砂根收载于《中国药典》（2020 版）中，并以岩白菜素含量做为朱砂根质量评价的指标性成分[3]，其质量标准可以得到良好的把控。而百两金和红凉伞却并未收载于《中国药典》中，目前也只载于贵州省地方标准中。所以对百两金和红凉伞的研究报道相对较少，严重影响其临床用药和生产的安全有效性。（2）《中国药典》明确规定朱砂根以根入药[3]，而《中药大辞典》中却明确朱砂根的根和叶均可入药，且把朱砂根的叶单独拿出来作为一类中药[4]。目前市场销售的朱砂根在使用方面大多数以根茎混合使用，少有的只以根入药。那么朱砂根的茎叶与根的化学成分差异大吗？是否可以入药？（3）苗药八爪金龙基原复杂，药材市场在八爪金龙的售卖使用过程中存在着朱砂根、百两金、红凉伞这3 个不同基原混合入药以及药用部位混乱等情况。如何最大化利用八爪金龙药用资源等问题都亟待研究。因此，为了探讨这些问题，本实验建立了八爪金龙这3 种基原的不同药用部位的HPLC 图谱，并对朱砂根、红凉伞和百两金不同药用部位的指标性成分岩白菜素进行了含量测定，通过质量控制方面横向比较八爪金龙这3个基原的差异性，为苗药八爪金龙药材资源的进一步开发和利用奠定科学基础。

1 材料与设备

1.1 仪器

Agilent-1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；DAD 二极管阵列检测器（安捷伦科技有限公司）；SB-600DTY 超声波多频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；FA2104N 电子天平（上海菁海仪器有限公司）；XS205 电子天平（瑞士梅特勒公司）；FW177 中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 材料

YMC-PackODS-A（250 mm×4. 6 mm，5μm）的色谱柱（日本YMC 公司）。

UN1648 乙腈（GR 赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；甲醇（GR 美国BCR 公司）；H3PO4（GR 天津市科密欧化学试剂有限公司）；岩白菜素（CR 成都瑞芬思生物科技有限公司）；屈臣氏饮用水（AR 广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.3 药材

朱砂根和百两金采自贵州省贵阳市南明区情人谷，红凉伞采自贵州省凯里市雷公山，药材经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为朱砂根（Ardisia crenata Sims）、红凉伞[Ardisia crenata Sims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen]、百两金[Ardisia crispa（Thunb.）A.DC]的全株。

2 方法与结果

2.1 八爪金龙不同基原药材相似度考察

2.1.1 供试品和对照品溶液的制备 将不同基原的八爪金龙全草阴干，根茎叶分离，打粉，取八爪金龙药材的不用药用部位粉末各2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声（频率 40kHz）提取 40min，放冷，补重，摇匀，过滤，取续滤液，用0.22μm 针式过滤器滤过，作为供试品待用。

2.1.2 HPLC-DAD 色谱条件 型号为YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm, 5μm）的色谱柱；以乙腈（A）－0.1% H3PO4（B）作为流动相；柱温为25℃；0.5mL·min-1的流速; 进样量的大小为 5μL；DAD 检测波长为 214nm；洗脱梯度为：0～15min，5%～10%A；15 ～35min，10%～10%A；35 ～65min，10%～24%A；65～80min，24%～40%A；80～85min，40%～50%A；85～90min，50%～5%A；90～95min，5%～5%A。

2.1.3 八爪金龙叠加图谱的建立 按2.1.2 项下色谱条件建立HPLC 色谱，将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A 版）中，建立八爪金龙不同基原的根、茎、叶叠加图谱，按照中位数生成对照图谱并设置时间窗为0.1，采用多点校正后进行自动匹配后生成叠加图谱，标定出其共有峰。色谱叠加图见图1，相似度匹配见表1。

图1 八爪金龙的根（A）、茎（B）、叶（C）HPLC 相似度叠加图Fig.1 Similarity superposition diagram of HPLC of root（A）,stem（B）and leaf（C）of Ardisia crispa（Thunb.）A.DC

表1 八爪金龙不同基元药材根部成分相似度匹配Tab.1 Similarity matching of root components of different base of Ardisia crispa（Thunb.）A.DC

通过对朱砂根和红凉伞的根、茎部进行HPLC图谱比较可以发现，朱砂根和红凉伞的相似度可以达到0.9 以上，二者的根茎极为相似,而在叶部相似度只有0.348，说明朱砂根与红凉伞的叶中化学成分存在着较大差异，这也为民间通过叶片颜色区分二者提供了理论依据。百两金不同药用部位与二者的相似度都仅有0.5 左右，说明百两金与朱砂根和红凉伞在化学成分上存在着较大的差异。

2.2 八爪金龙不同药用部位岩白菜素含量测定

2.2.1 供试品和对照品溶液的制备 将不同基原的八爪金龙全草阴干，根茎叶分离，打粉，过20 目筛，取八爪金龙药材的不用药用部位粉末各0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，超声（频率 40kHz）提取 40min，放冷，补重，摇匀，滤过，取续滤液用0.22μm 有机针式滤膜滤过，作为供试品待用。精密称量岩白菜素对照品10.00mg 加入100%甲醇溶液定容至10mL 棕色容量瓶,摇匀,配成 1mg·mL-1的对照品储备液。

2.2.2 HPLC-DAD 色谱条件 型号为YMC-Pack－ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）的色谱柱；以甲醇-水（25∶75）作为流动相；柱温为 30℃；1.0mL·min-1的流速; 进样量的大小为5μL；DAD 检测波长为214nm。在本试验色谱条件下，八爪金龙药材中岩白菜素的分离度R>1.5,符合要求，建立了八爪金龙不同基原的3D 叠加图谱，结果见图2。

图2 岩白菜素对照品（D）及朱砂根（E）红凉伞（F）百两金（G）不同药用部位HPLC 的3D 叠加图Fig.2 3D overlay map of HPLC of Bergenin reference substance（D）and Ardisia crenata Sims（E）Ardisia crenata Sims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen（F）Ardisia crispa（Thunb.）A.DC.（G）

2.2.3 线性关系的考察 精密称定岩白菜素对照品10.00mg 加入100%甲醇溶液定容至10mL 棕色容量瓶,摇匀,配成母液 1mg·mL-1的溶液,再倍数稀释成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg·mL-1浓度备用。精密吸取上述对照品溶液各5μL 按照2.2.2 的HPLC-DAD 色谱条件注入液相色谱议,测定峰面积,以被测物质的浓度（mg·mL-1）为横坐标（X）,以峰面积为纵坐标（Y）,绘制标准曲线,其回归方程、相关系数、线性范围，结果回归方程为Y=21396x+124.31（R2=0.9992）且质量浓度在 1.0～0.015625mg·mL-1范围内线性关系良好。

图3 岩白菜素标准曲线图Fig.3 Standard curve of Bergenin

2.2.4 精密度试验 取2.2.1 岩白菜素1mg·mL-1储备液，按照2.2.2 项下的色谱条件连续进样6 次，结果岩白菜素的保留时间和峰面积的RSD 值分别为0.56%和0.13%，表明该仪器的精密度良好。

2.2.5 重复性试验 精密称取不同药用部位的供试品6 份，制备供试品溶液，按2.2.2 项下色谱条件测定，结果岩白菜素色谱峰的相对保留时间和峰面积的RSD 均小于3% ，表明该方法的重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 精密量取供试品溶液适量，分别在 0、2、4、6、8、10、12 和 24h ，按“2.2.1”项下色谱条件检测，计算岩白菜素色谱峰相对保留时间和峰面积的RSD 均小于3%，表明供试品溶液在24h 内稳定性良好。

2.2.7 加样回收试验 取已知各成分含量的八爪金龙药材粉末，精密称取6 份样品，每份药材约0.1g，分别精密加入各对照品适量。按“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，在2.2.2 项色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算相应含量，并求回收率。岩白菜素的平均加样回收率在 99.73%～103.33%，RSD 在0.75%～2.67%。表明方法准确性良好。

2.2.8 样品含量测定 分别取朱砂根、红凉伞以及百两金不同部位（根、茎、叶）粉末，按 2.2.1 项下方法制备供试品溶液，在2.2.2 项色谱条件下进样分析，计算岩白菜素的含量，结果见表2。

表2 八爪金龙不同药用部位岩白菜素含量Tab.2 Contents of Bergenin in different parts of Ardisia crispa（Thunb.）A.DC.

数据结果显示，朱砂根叶中的岩白菜素含量明显大于根和茎中岩白菜素含量，茎中岩白菜素含量略大于根中岩白菜素含量，红凉伞叶中的岩白菜素含量特别低，与朱砂根叶中岩白菜素含量形成鲜明对比。朱砂根和红凉伞在根和茎中岩白菜素含量十分的接近，朱砂根根中的岩白菜素与红凉伞根中含量接近而茎中含量要高出少许。百两金中岩白菜素的含量要比朱砂根和红凉伞中都少的多，相对于根和茎中百两金叶中岩白菜素含量会更多一点。

3 讨论

红凉伞是朱砂根的变种，二者在植株外形无太大差异，仅红凉伞叶背、花梗、花萼和花瓣均带紫红色，因此《中国植物志》记载，二者作为单独的两个种是不恰当的，也提出了给予归并[5]。赵爱莲通过叶绿体DNAtrnL-trnF 片段测序[6]和陈新连通过ITS2 序列[7]也无法将二者进行鉴别。汤昊也通过聚类分析发现朱砂根和红凉伞在第一阶就被聚成一类，表明两者亲缘关系极近，很难鉴定区别[8]。所以笔者通过HPLC 法将二者与同基原的百两金进行了化学成分比较。

通过对朱砂根、红凉伞和百两金HPLC 图谱相似度考察发现朱砂根和红凉伞化学成分在根、茎部十分的相似，而叶中的化学成分却存在着较大的差异，这为民间仅通过叶片颜色区分二者提供了理论依据。而百两金药材无论在根茎还是叶中与朱砂根和红凉伞都存在着较大的差异。对八爪金龙药材不同药用部位进行岩白菜素的含量测定发现：朱砂根叶中的岩白菜素含量明显大于根和茎中岩白菜素含量，茎中岩白菜素含量略大于根中岩白菜素含量，红凉伞叶中的岩白菜素含量特别低，与朱砂根叶中岩白菜素含量形成鲜明对比。朱砂根和红凉伞在根和茎中岩白菜素含量十分的接近，朱砂根根中的岩白菜素与红凉伞根中含量接近而茎中含量要高出少许。百两金中岩白菜素的含量要比朱砂根和红凉伞中都少的多，相对于根和茎中百两金叶中岩白菜素含量会更多一点。

4 结论

本实验通过HPLC 色谱法将朱砂根、红凉伞和百两金进行鉴别，发现朱砂根与红凉伞在根和茎的色谱行为是十分相近的，无法辨别出二者。但在叶化学成分的含量上面存在着一定的差异，可以做为区分二者的一个突破口。而百两金却与朱砂根和红凉伞的化学成分和色谱行为上存在较大差异，所以不建议将三者做为八爪金龙进行混合使用。通过对岩白菜素的含量测定发现：朱砂根叶中岩白菜素的含量特别高，朱砂根和红凉伞的茎中的岩白菜素含量也不比根中少，所以建议将朱砂根的茎和叶还有红凉伞的茎做为药用部位充分的使用起来，这样可以使八爪金龙的药用资源得到充分的开发利用。