丁香降气颗粒的研制及质量标准研究

柴蓉蓉，高佳莺，潘会君，朱全刚

（上海市皮肤病医院 一期临床试验中心，上海 200443）

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一种常见的消化道动力障碍性疾病，由于胃腔和食管过度接触胃液而引起临床胃食管反流症和食管黏膜损伤，患者主要表现为反酸、烧心、胸骨后疼痛等[1-4]。目前临床常用质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）治疗GERD，PPI可高效快速抑制胃酸分泌，但没有从根本解决反流症状，复发率高，需要长期维持治疗。丁香降气方是治疗胃食管反流病的经验方，由丁香、焦山栀、枳壳、柴胡等10味药材组成，采用疏肝和胃法治疗胃食管反流病患者有良好的效果。但在临床上患者常用汤剂，服药不便。颗粒剂具有服药方便、便于携带及储藏等优点，所以本研究将丁香降气方制成丁香降气颗粒，对其提取和制剂工艺进行优化，并制定了严格的质量标准，可用于丁香降气颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ODS C18柱（日本岛津公司）；ZORBAX SB C18柱（美国安捷伦公司）；ES225SM-DR十万分之一电子分析天平（瑞士赛普利斯）；万分之一电子分析天平（北京赛多利斯；CQ-250-DST型超声波清洗仪（上海跃进）；DHG-9071型电热鼓风恒温干燥箱（上海浦东荣丰）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏）；RE-52CS型旋转蒸发器（雅莱）；XMTE-8112型电热恒温水浴锅（上海精宏）；WFH-203B型三用紫外分析仪（上海驰唐）。

1.2 试药

炒枳壳，焦栀子，北柴胡，姜汁黄连，黄精，吴茱萸，金沸草，丁香，厚朴，煅瓦楞子，均购自上海虹桥中药饮片有限公司，经同济大学附属皮肤病医院药剂科潘会君博士鉴定符合药典标准；柚皮苷对照品（批号：14072545，纯度为98 %），栀子苷对照品（批号：110749-201115，纯度为98 %），盐酸小檗碱，厚朴酚，和厚朴酚，黄精对照药材，均购自中国食品药品检定研究院；糊精，一水乳糖（上海昌为医药辅料技术有限公司）；丁香降气颗粒（自制，批号：15021301，15021302，15021303）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 柚皮苷测定色谱条件 色谱柱：ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-1 %磷酸（22:78）；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：283 nm；进样量：10 μl。

2.1.2 栀子苷测定色谱条件 色谱柱：ZORBA SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25:75）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：238 nm；进样量：10 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷对照品3.12 mg，栀子苷对照品3.05 mg，分别置于10 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为312 μg/ml的柚皮苷对照品溶液和浓度为305 μg/ml的栀子苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取丁香降气颗粒约0.15 g，精密称定于20 ml量瓶中，加甲醇适量，在20 Hz、500 W条件下超声20 min后放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液制成供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方量比例取缺枳壳或焦栀子的其余药材饮片，参照丁香降气颗粒制备工艺方法制成缺枳壳阴性样品和缺焦栀子阴性样品，按2.2.2项方法制备成缺枳壳阴性样品溶液和缺焦栀子阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取2.2项下柚皮苷、栀子苷对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按2.1项色谱条件进样，缺枳壳阴性样品在与柚皮苷对照品峰相同的保留时间处无色谱峰出现，表明丁香降气颗粒中其他成分不干扰柚皮苷的测定。柚皮苷阴性样品、对照品与丁香降气颗粒供试品的色谱图见图1。缺焦栀子阴性样品在与栀子苷对照品峰相同的保留时间处无色谱峰出现，表明丁香降气颗粒中其他成分不干扰栀子苷的测定。栀子苷阴性样品、对照品与丁香降气颗粒供试品的色谱图见图2。

图1 柚皮苷专属性考察HPLC图谱

图2 栀子苷专属性考察HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 将312 μg/ml柚皮苷对照品溶液配制成浓度为156.00，78.00，39.00，19.50，9.75 μg/ml的溶液；将305.00 μg/ml栀子苷对照品溶液配制成浓度为152.50，76.25，38.13，19.06，9.53 μg/ml的溶液。按2.1项色谱条件测定，记录峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得柚皮苷回归方程为Y=11.675X+10.16（r=1.0000），即柚皮苷在9.75～156.00 μg/ml内呈现良好的线性关系；栀子苷回归方程为Y=13.245X+16.092（r=0.9999），即栀子苷在9.53～152.50 μg/ml内呈现良好的线性关系。

2.3.3 日内精密度实验 分别吸取高、中、低3种浓度的柚皮苷对照品溶液（浓度分别为312，78.00，9.75 μg/ml）和高、中、低3种浓度的栀子苷对照品溶液（浓度分别为152.50，76.25，9.53 μg/ml），按2.1项色谱条件，连续测定5次，高、中、低浓度的柚皮苷对照品溶液的峰面积RSD分别为0.95 %，0.45 %，0.57 %，高、中、低浓度的栀子苷对照品溶液的峰面积RSD分别为1.21 %，1.26 %，0.88 %，结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 日间精密度实验 分别吸取高、中、低3种浓度的柚皮苷对照品溶液（浓度分别为312，78.00，9.75 μg/ml）和高、中、低3种浓度的栀子苷对照品溶液（浓度分别为152.50，76.25，9.53 μg/ml），按2.1项色谱条件，每天进样一次，连续测定5 d，高、中、低浓度的柚皮苷对照品溶液的峰面积RSD分别为1.98 %，1.63 %，2.50 %，高、中、低浓度的栀子苷对照品溶液的峰面积RSD分别为0.93 %，0.94 %，1.63 %，结果表明对照品溶液5 d内稳定性良好。

2.3.5 稳定性试验 取丁香降气颗粒约0.15 g，精密称定，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12 h进样，测得栀子苷、柚皮苷峰面积的RSD值分别为0.38 %和0.21 %，结果表明供试品溶液的稳定性良好。

2.3.6 重复性实验 取丁香降气颗粒6份，每份约0.15 g，精密称定，按2.2.2项方法平行制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，测得柚皮苷、栀子苷的平均含量分别为1.50，1.21 mg，RSD分别为2.05 %和1.98 %。结果表明方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率实验 取丁香降气颗粒约0.04 g，精密称定于10 ml量瓶中，平行9份，分别加入约相当于样品中柚皮苷和栀子苷含量的 80 %，100 %，120 % 的对照品溶液适量，各平行3份；按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，测得柚皮苷、栀子苷的平均回收率分别为96.54 %，103.62 %，RSD分别为0.16 %，0.44 %。

2.4 提取正交试验

选择加水量（A）、煎煮时间（B）、提取次数（C）为因素，平行操作下，按L9（34）正交设计进行试验，以浸膏得率和柚皮苷、栀子苷含量为考察指标，计算综合评分，权重为干浸膏得率40 %、柚皮苷40 %、栀子苷20 %，并对结果进行直观分析和方差分析。由表1可得出9次实验的综合评分。由表2可知：影响丁香降气颗粒水提工艺的因素顺序为C（提取次数）＞A（加水量）＞B（提取时间），因素A以2水平时最佳，因素B以2或3水平时最佳，因素C以3水平时最佳；因素C对实验结果有显著影响，因素A、B对实验结果均无显著影响。由此得到最佳组合为A2B3C3或A2B2C3。随着加水量的增加，浸膏得率和指标成分的含量也会增加，但在加水量为10倍后，增加的量可以忽略不计，考虑到节约能源，降低生产成本，采用提取工艺为A2B2C3，即加水量10倍，煎煮时间1.0 h，提取次数3次。

2.5 辅料筛选

2.5.1 辅料种类筛选 分别将糊精、乳糖与干燥浸膏粉按辅料:浸膏粉比例1:1混合，选用95 %乙醇作为润湿剂，制备颗粒，以颗粒的成型率、溶化性、成本价和制粒难易度为评价指标筛选辅料。结果表明，糊精的成型率、制粒难易度明显优于乳糖；乳糖溶化性较好，但吸湿后容易液化，使颗粒黏连，颜色变深，且乳糖的价格较高，所以选择糊精作为辅料。

2.5.2 辅料用量筛选 将辅料与浸膏粉分别按1:1，2:3，1:2不同比例混合制粒，在颗粒能成型的条件下，按辅料最少原则确定辅料与浸膏粉比例。选用95 %乙醇作为润湿剂制备颗粒。当糊精与浸膏粉比例为1:2时即可制成颗粒，本着辅料用量最小的原则，确定辅料与浸膏粉比例为1:2。

表1 正交试验结果

表2 丁香降气颗粒提取工艺正交试验直观分析表

2.5.3 润湿剂浓度及用量筛选 将辅料与浸膏粉按1:2的比例混合，分别加入浓度为50 %，75 %，80 %，95 %的乙醇，用量为浸膏与辅料混合粉末总量的2 %，5 %，8 %，制备颗粒。以成型率为评价指标，优选最佳制剂工艺条件。由实验结果可知，颗粒剂的得率随乙醇用量的增加而增加；乙醇浓度为95 %时，得率最高，但考虑到成本及乙醇浓度高容易产生安全问题，选用80 %的乙醇作为润湿剂，用量为混合粉末总量的8 %。

2.6 丁香降气颗粒的制备方法

将干浸膏打粉，过80目筛，加入辅料后混合均匀，喷以75 %乙醇作为润湿剂，搅拌到手捏成团，触之即散时，摇摆制粒机制粒，65 ℃干燥2 h，过四号筛整粒后即得。以优化所得工艺条件进行3次验证实验，考察丁香降气颗粒的成型率、溶化性和制粒难易度。丁香降气颗粒的成型率、溶化性和制粒难易度均较好，说明制剂工艺实验得到的工艺条件切实可行。

2.7 薄层色谱鉴别

按照中国药典2015年版四部中的薄层鉴别方法[5]对丁香降气颗粒中的枳壳、焦栀子、姜汁黄连、厚朴和黄精进行鉴别。

2.7.1 枳壳薄层鉴别 称取丁香降气颗粒样品（批号：15021301，15021302，15021303）2.00 g，加甲醇10 ml，超声30 min，取续滤液，制成供试品溶液备用。称取枳壳对照药材粉末0.40 g，参考供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。称取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方量比例取缺枳壳的其余药材饮片，参照丁香降气颗粒制备工艺方法制成阴性样品，按供试品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版附录）实验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液及对照药材溶液各1 μl、对照品溶液5 μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:6:2）下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3 %三氯化铝乙醇溶液，105℃加热约5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.7.2 焦栀子薄层鉴别 称取丁香降气颗粒样品（批号：15021301，15021302，15021303）2.00 g，加乙醇10 ml，超声20 min，取续滤液，制成供试品溶液备用。称取栀子对照药材粉末1.00 g，参考供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。称取栀子苷对照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方量比例取缺焦栀子的其余药材饮片，参照丁香降气颗粒制备工艺方法制成阴性样品，按供试品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版附录）实验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液及对照药材溶液各8 μl、对照品溶液5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100:10:5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，110 ℃加热至斑点显色清晰。

2.7.3 姜汁黄连薄层鉴别 称取丁香降气颗粒样品（批号：15021301，15021302，15021303）5.00 g，加甲醇25 ml，超声30 min，取续滤液，制成供试品溶液备用。称取黄连对照药材粉末0.25 g，参考供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。称取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方量比例取缺姜汁黄连的其余药材饮片，参照丁香降气颗粒制备工艺方法制成阴性样品，按供试品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版附录）实验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液及对照药材溶液、对照品溶液各1 μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）为展开剂，浓氨试液预饱和20 min，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.7.4 厚朴薄层鉴别 称取丁香降气颗粒样品（批号：15021301，15021302，15021303）2.00 g，加甲醇10 ml，超声30 min，取续滤液，制成供试品溶液备用。称取厚朴对照药材粉末1.00 g，参考供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。称取厚朴酚、和厚朴酚对照品， 加甲醇分别制成每1 ml含0.5 mg对照品的溶液。按处方量比例取缺厚朴的其余药材饮片，参照丁香降气颗粒制备工艺方法制成阴性样品，按供试品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版附录）实验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液及对照药材溶液各8 μl、厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液各1 μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以甲苯-甲醇（17:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。

2.7.5 黄精薄层鉴别 称取丁香降气颗粒样品（批号：15021301，15021302，15021303）2.40 g，加70 %甲醇20 ml，加热回流1 h，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10 ml使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。称取黄精对照药材粉末1.00 g，参考供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方量比例取缺黄精的其余药材饮片，参照丁香降气颗粒制备工艺方法制成阴性样品，按供试品溶液制备方法同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版附录）实验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液及对照药材溶液各8 μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5:2:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5 ℃香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。

图3 A～E分别为枳壳、焦栀子、姜汁黄连、厚朴、黄精的薄层鉴别结果。以上供试品薄层色谱中，在与对照药材及对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品未见干扰。

图3 各成分薄层鉴别结果

2.8 指标性成分含量测定

取3批丁香降气颗粒样品（批号：15021301，15021302，15021303），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，每个批号平行操作3次，按2.1项下色谱条件进样测定，记录柚皮苷、栀子苷的峰面积，计算柚皮苷和栀子苷的浓度，结果见表3。由表3可知，丁香降气颗粒每克中含柚皮苷应不少于9.50 mg，每克中含栀子苷应不少于7.00 mg。

2.9 颗粒剂质量标准制定

照中国药典2015年版四部中颗粒剂质量标准要求，对丁香降气颗粒的粒度、堆密度、休止角、水分、溶解性和装量差异进行测定。丁香降气颗粒3个批次的粒度差异较小，各自的粒度均不小于85.0 %，休止角应小于0.4480，堆密度应在0.4445～0.5735之间，各批次颗粒的水分都小于6 %，3个批号颗粒均全部溶解，且杯底无浑浊，没有发现异物和焦屑，表明该颗粒的溶解性良好，检查的10袋供试品装量差异均在药典规定范围之内，且无一袋超出±5 %范围。丁香降气颗粒的质量标准符合药典要求。

表3 不同批号样品测定结果

3 讨论

初步药效学研究表明，丁香降气方能改善反流性食管炎大鼠食管黏膜的病理状况，其作用机制可能与下调模型大鼠食管黏膜炎性细胞因子白介素8（IL-8）、IL-23、IL-17的表达、减轻食管炎症有关[6-7]；还能通过增加胃体和胃窦平滑肌内的免疫活性细胞（ICC）数量，促进胃排空，改善胃动力，治疗胃食管反流病。

丁香降气颗粒提取工艺采用水提法，可保证丁香降气颗粒与临床汤剂药效基本一致。该制剂由十味中药组成，丁香在处方中用量小，且丁香酚疏肝和胃效果不明显，故不将其作为指标性成分。柚皮苷具有抗炎镇痛作用，同时可抑制脂多糖诱导的肿瘤坏死因子（TNF）释放所造成的肝损害[8]；栀子苷具有解热镇痛、抗炎、保肝利胆作用[9]，对治疗胃食管反流病能起到关键效果，因此本制剂选用栀子苷和柚皮苷为指标性成分。由于丁香降气方中不含坚硬的动植物药材及含淀粉、蛋白质较多的药材，故浸泡时间的长短对有效成分影响不大，所以不将煎煮时间作为因素之一，所有药材饮片统一浸泡20 min。

由于胃食管反流病临床治疗周期较长，患者需长期服药；且该处方药量大，药物提取物含量较高，不适于制成片剂和胶囊；而颗粒剂既保持了汤剂吸收快、显效迅速的特点，又克服了汤剂需服用前临时煎煮、久置易霉变、携带不便的缺点；颗粒剂易溶解、易吸收，生物利用度优于片剂，且制备工艺比片剂、胶囊简单，故将丁香降气方制成颗粒剂。考虑到老年患者及糖尿病患者服用，拟采用无糖型颗粒剂[10]。本研究优化了丁香降气颗粒的提取和制剂工艺，建立了质量标准，为丁香降气颗粒的生产提供了依据。