基于近红外光谱技术的当归养血丸多指标成分快速分析与质量评价

闫 研，谢耀轩，秦 斌，王铁杰，殷 果

（深圳市药品检验研究院 深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057）

当归养血丸由当归、白芍和地黄等十味药材组成，收载于《中国药典》2015年版（一部），具有益气养血调经功效，在临床上多用于治疗月经不调、气血两虚等疾病[1]。在质量控制方面，《中国药典》2015年版只规定了当归、丹皮酚显微鉴别项和薄层色谱（TLC）鉴别项，缺少含量测定项[1]；在含量测定方面，仅见相关文献采用高效液相法分别测定阿魏酸、芍药苷[2-7]。上述定性分析手段存在技术要求高、操作复杂、无法用于现场快速监察等缺点。

近红外光谱法（NIR），操作简单，无需对样品进行前处理，无需消耗其他材料或试剂，是一种绿色环保的快速分析方法。近红外光谱法以其快速、无损、绿色环保的特点广泛应用于药品定性、定量分析中[8-9]，随着技术发展成熟，逐渐应用于中药材、饮片的快速检测，对于有效控制中药质量有重要应用价值[10-16]。

本研究以2019年国家药品评价性抽验为契机，采用NIR建立当归养血丸的一致性检验模型，及包含水分、芍药苷、丹皮酚在内的多指标成分的定量分析模型，用于当归养血丸的快速定性鉴别和多成分定量分析与评价，以满足当归养血丸药品质量控制的需要。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MATRIX-F型近红外光谱仪，附有光纤探头，InGaAs检测器，OPUS5.0软件。

1.2 试药

本次国家评价性抽验的样品共涉及3个生产厂家的11批次当归养血丸，经深圳市药品检验研究院中药检验室符合性检验，合格率为100 %，另收集了与其功能和成分相近的药品4批，样品信息详见表1。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 含量测定

按《中国药典》2015年版通则0832水分测定法第四法操作[1]，测得当归养血丸水分的含量范围为4.9 %～9.0 %；参考文献方法[2]测得芍药苷的含量范围为1.30～2.37 mg/g ；参考文献方法[6]测得丹皮酚的含量范围为0.50～1.25 mg/g，各指标成分测定值详见表2。

2.2 光谱的采集

采用漫反射扫描法，通过光纤探头采集样品NIR图谱。以仪器内置背景为参比，波数范围12 000～4000 cm-1，扫描累加次数32次，分辨率8 cm-1，每批次样品重复测定6张光谱，作为原始光谱。1～15号样品近红外光谱叠加图详见图1～2。

2.3 当归养血丸（A公司）一致性检验模型

近红外一致性检验模型是通过一致性指数（CI）值和CI限度比较法初筛样品，方便快捷，准确率高[8]。当样品量充足（≥3批次）时，可建立一致性检验模型对药品的真伪进行鉴别，亦可针对品牌产品建立一致性检验模型，用于对市场上该品牌药进行快速筛查。本研究对A公司和B公司两家企业的当归养血丸分别建立一致性检验模型，以区分不同厂家的当归养血丸（品牌鉴别），或将当归养血丸和与其成分、功能相近的产品区分（真伪鉴别）。

表2 各指标成分含量测定结果

图1 样品近红外原始光谱叠加图

图2 近红外二阶导数加矢量归一化处理光谱图

2.3.1 模型的建立 调取编号1～7样品的42张原始光谱作为参考光谱，按照中国食品药品检定研究院发布的《近红外光谱采集与建模技术规范》要求，采用二阶导数+矢量归一化法对原始光谱进行预处理，平滑点数为13，选择特征谱段在9000～7500 cm-1、6900～5600 cm-1和5000～4250 cm-1，CI限度为5，建立当归养血丸（A公司）一致性检验模型，详见表3和图3。

表3 一致性检验模型参数列表

2.3.2 模型的验证 调取编号10～15样品各一张图谱，共6张光谱作为检验光谱，对当归养血丸（A公司）一致性检验模型进行验证。验证结果见图3，6批样品的CI值均远大于规定的CI限度5，验证样品与建模样品差异显著，说明该模型专属性好，准确性高，能有效区分当归养血丸（A公司）与不同生产厂家的同类产品及功能和成分相近的其他产品。

图3 当归养血丸（A公司）一致性检验模型验证结果

2.4 当归养血丸（B公司）一致性检验模型

2.4.1 模型的建立 调取编号8～10样品的原始光谱作为参考光谱，采用二阶导数+矢量归一化法对原始光谱进行预处理方法，平滑点数为13，选择特征谱段在9000～7500 cm-1，6900～5600 cm-1和5000～4250 cm-1，CI限度为7，建立一致性检验模型，详见表4和图4。

表4 一致性检验模型参数列表

2.4.2 模型的验证 调取编号7，11～15样品各一张图谱，共6张光谱作为检验光谱，对当归养血丸（B公司）一致性检验模型进行验证。验证结果见图4，6批样品的CI值均远大于规定的CI限度7，验证样品与建模样品差异显著，说明该模型专属性好，准确性高，能有效区当归养血丸（B公司）与不同生产厂家的同类产品、以及功能和成分相近的其他产品。

2.5 多指标成分定量模型

采用偏最小二乘法（PLS）对当归养血丸中水分、芍药苷、丹皮酚这3个关键指标成分建立定量分析模型，用以预测未知样品中各指标成分的含量。

图4 当归养血丸（B公司）一致性检验模型验证结果

2.5.1 模型的建立及优化 运用OPUS分析软件，分别采用一阶导数+多元散射校正（First Derivative+MSC）、一阶导数+矢量归一化（First Derivative+Vector Normalization）、一阶导数+直线差值（First Derivative+Straight Line Subtraction）等 11种光谱预处理方法在12 000～4000 cm-1范围内对光谱预处理方法和光谱范围做系统的优化，通过内部交叉验证筛选较为优化的模型参数，详见表5。

表5 不同建模参数对各指标定量模型的影响

以相关系数（R2）和交叉验证均方差（RMSECV）作为衡量指标，R2越接近1，RMSECV值越小，模型的精确度越高，最终确定各指标定量模型的建模参数，详见表6。

2.5.2 模型的验证 运用已建立的各指标定量模型对各指标含量进行预测，并与实测值比较，结果见表7。预测值与实测值相关性见图5，预测误差分布见图6。各指标定量分析模型内部交叉验证相关系数（R2）分别为0.9492，0.9166，0.9260，交叉验证均方根偏差（RMSECV）分别为0.290 %，0.0833 mg/g，0.0726 mg/g，模型的预测能力良好。

3 讨论

本研究因样品数量有限，采用内部交叉验证的方法建模和验证，以保证模型的准确性。交叉验证方法是：首选取出一个样本，将剩余的样本建立一个临时模型，使用该模型来预测取出的这个样本，如此重复、循环直至每个样本均被检验分析，特点是每个样品均被用于建模和验证，适用于样品数量有限（小于50个样本）的系统建模，但运算量较大。因此，在后续研究中应收集更多、更具代表性的当归养血丸样品，不断扩充到模型中，使模型更为稳健、适用性更广。

表6 各指标定量模型的建模参数

表7 各指标定量模型预测值与实测值比较

图5 各指标定量模型预测值与实测值相关图

图6 各指标定量模型预测误差分布图

4 结论

本研究利用NIR分析技术，针对不同厂家的建立的一致性检验模型可以快速鉴别当归养血丸，所建模型专属性好，准确性高，可快速准确鉴别出不同厂家的当归养血丸，可快速准确地区分当归养血丸和与其功能、成分相近的同类产品。针对水分、芍药苷和丹皮酚3个关键指标成分建立的当归养血丸定量分析模型准确性高，预测偏差在合理范围内，可用于未知样品多指标成分的含量预测。本研究建立的NIR快速分析方法操作简单易掌握，样品无需处理，为当归养血丸多指标成分快速、无损检测和质量控制提供了技术支持，具有广阔的应用前景。