逐瘀止痛远红外灸贴的质量标准研究

毕建云，张 静，赵云涛，刘文静，孙 玉，刘雅楠

（1. 山东中医药大学实验中心，山东中医药大学创新研究院，山东 济南 250355；2. 山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）

中药凝胶贴膏[1-2]因载药量大，含水量高，刺激性小，生物相容性好，使用方便等优势，是继口服、注射给药系统之后很有发展潜力的中药给药系统之一，近年成为外用制剂研发的热点[3]。现对传统中药煎剂进行剂型改良，将血府逐瘀汤剂[4-5]制成一种透气性好、贴敷舒适的新型经皮给药剂型——逐瘀止痛远红外灸贴，满足中药制剂现代化生产的要求[6]。在热敷条件下，可促进中药组方中有效成分的透皮吸收，能有效改善血液循环、可用于治疗痛经、月经不调、产后恶露不绝、腰腹疼痛等妇科常见病、多发病。现对该制剂进行质量标准研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型液相仪（日本岛津），检测器为SPD-20A紫外可见检测器，泵为LC-20AT，工作站：LC-Solution；FA2004B电子天平（赛多利斯）；ZOLLO-650CT型多功能恒温超声波提取器（上海左乐），ZF-1型三用紫外灯分析仪（杭州奇威）。

1.2 试药

硅胶G（青岛海洋化工）；乙酸乙酯，甲醇，乙醇等所用试剂均为分析纯，乙腈为色谱纯，供含量测定用；桔梗（批号：121028-201612），川芎（批号：120918-201813），当归（批号：120927-201617），枳壳（批号：120981-201605），牛膝（批号：121066-201809），供薄层鉴别用，均购于中国食品药品检定研究院；芍药苷（批号：FY1265VX53J，供含量测定用，南通飞宇）；苦杏仁苷（批号为110736-201842，供含量测定用，上海经科）；藁本内酯（批号为181216，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；逐淤止痛远红外灸贴共3批（山东中医药大学药学实验室研制，批号为20191206，20191210，20191214）。

2 方法和结果

2.1 桔梗鉴别[7]

2.1.1 供试品溶液制备 取16.5 g药膏，剪碎，加入3 ml盐酸、30 ml水，加热回流1 h，冷却滤过，滤液用乙酸乙酯提取2次，每次50 ml，合并乙酸乙酯，蒸干，1 ml甲醇溶解，即得。

2.1.2 对照药材溶液制备 取0.5 g桔梗对照药材，同供试品溶液的制备方法制得桔梗对照药材溶液。

2.1.3 空白对照液制备 按处方比例称取除桔梗的剩余药材共6.8 g，采用逐淤止痛远红外灸贴的制备方法制备缺桔梗的贴片，采用供试品制备方法制得缺桔梗的空白对照液。

2.1.4 TLC实验及结果 吸取空白对照液8 μl，供试品溶液8，10 μl；对照药材溶液6，10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:乙醚（3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品与对照药材特征斑点明显，空白对照相应位置无斑点，表现了该法良好的重现性、专属性和层析效果，见图1。

图1 桔梗的TLC鉴别

2.2 牛膝鉴别

2.2.1 供试品溶液制备 取所制备贴膏22 g，剪碎，加50 ml甲醇，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干。残渣用20 ml水溶解，加入50 %乙醇和1 ml稀盐酸，摇匀。用无水乙醚振摇提取2次，每次25 ml，合并乙醚提取液（备用），取下层酸水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇提取液；用氨试液洗涤两次，每次20 ml，弃去氨试液，蒸干正丁醇，残渣加1 ml甲醇使溶解，即得。

2.2.2 对照药材溶液制备 取1 g牛膝对照药材，同供试品溶液的制备方法制得牛膝对照药材溶液。

2.2.3 空白对照液制备 按处方比例称取除牛膝的剩余药材共7.12 g，采用逐淤止痛远红外灸贴的制备的方法制备缺牛膝的贴片，采用供试品的制备方法制备缺牛膝的空白对照液。

2.2.4 TLC实验及结果 吸取空白供试品溶液6 μl，供试品溶液8，10 μl；对照药材溶液6，10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇（10:1）为展开剂，展开，取出，晾干；在紫外灯（365 nm）下检视，若不清晰，喷10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃烘干10 min，在紫外灯（365 nm）下检视。供试品与对照药材在同一位置有相同的斑点，空白对照处无斑点，且层析各斑点分离明显，表明该法层析分离、重现性和专属性均较好，见图2。

图2 牛膝的TLC鉴别

2.3 川芎、当归鉴别

2.3.1 供试品溶液制备 取2.2.1中备用的乙醚溶液，用水洗涤两次，每次25 ml，弃去水洗液，蒸干乙醚，残渣加2 ml甲醇使溶解，即得。

2.3.2 对照药材溶液制备 取当归、川芎对照药材各1 g，同供试品溶液的制备方法制得当归、川芎对照药材溶液。

2.3.3 空白对照液制备 按处方比例称取除牛膝的剩余药材共7.06 g，采用逐淤止痛远红外灸贴的制备的方法制备缺川芎、当归的贴片，采用供试品的制备方法值得缺川芎、当归的空白对照液。

2.3.4 TLC实验及结果 吸取空白供试品溶液4 μl，供试品溶液4，8 μl；对照药材溶液各1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷:乙酸乙酯（9:1）为展开剂，展开，取出，晾干；在紫外灯（365 nm）下检视。供试品与对照品存在相同的特征斑点，空白对照处无可见斑点，各斑点分离明显，该法重现性和专属性均较好，见图3。

图3 川芎、当归的TLC鉴别

2.4 枳壳鉴别

2.4.1 供试品溶液制备 取24 g所制备贴膏，剪碎，加40 ml甲醇没过，超声提取1h，静置2h，滤过，滤液浓缩至稠状，残渣加20 ml水溶解，加50 %乙醇10 ml、1 ml稀盐酸，摇匀。用乙醚振摇提取两次，每次25 ml，弃去乙醚液，保留酸水溶液；用乙酸乙酯振摇提取两次，每次25 ml，合并乙酸乙酯提取液。用水洗涤两次，弃去水洗液。蒸干乙酸乙酯，残渣加1 ml甲醇使溶解，即得。

2.4.2 对照药材溶液制备 取1 g枳壳对照药材，加10 ml甲醇，超声提取0.5 h，滤过，即得。

2.4.3 空白对照液制备 按处方比例称取除枳壳的剩余药材共11.16 g，采用逐淤止痛远红外灸贴的制备方法制备缺枳壳的贴片，采用供试品的制备方法制得缺枳壳的空白对照液。

2.4.4 TLC实验及结果 吸取空白供试品溶液6 μl，供试品溶液6，8 μl；对照药材溶液2，4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇水（13:6:2）下层为展开剂，展开，取出，晾干；在紫外灯（365 nm）下检视，若不清晰，喷三氯化铝乙醇试液，105 ℃烘干10 min，在紫外灯（365 nm）下检视。供试品与对照品相同的位置有相同的斑点，空白对照处无可见斑点，该法层析分离效果良好，重现性和专属性均较好，见图4。

图4 枳壳的TLC鉴别

2.5 HPLC含量测定[8-10]

2.5.1 供试品溶液制备 取重量差异下的所制备贴膏1贴，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 %甲醇 50 ml，称定重量，水浴加热回流1 h，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，离心5 min，取上清，即得。

2.5.2 对照品溶液制备 精密称取芍药苷对照品配成浓度为0.25 mg/ml对照品溶液；精密称取苦杏仁苷对照品，配成浓度为0.6 mg/ml对照品溶液；精密称取藁本内酯对照品，配成浓度为0.1 mg/ml对照品溶液。

2.5.3 色谱条件 芍药苷：色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1 %磷酸（15:85）；流速1 ml/min；检测波长230 nm；进样量10 μl；柱温30 ℃。

苦杏仁苷：色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（20:80）；流速1 ml/min；检测波长210 nm；进样量10 μl；柱温30 ℃。

藁本内酯：色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（80:20）；流速1.0 ml/min；检测波长325 nm；进样量10 μl；柱温 25 ℃。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 专属性试验 分别精密吸取2.5.1项下对照品溶液，2.5.2项下供试品溶液各10 μl，按2.5.3项下色谱条件测定。结果表明，样品中芍药苷、苦杏仁苷和藁本内酯分别在19，25和9 min处有较好峰形，表明方法专属性良好，见图5～13。

图5 芍药苷对照品HPLC图谱

图6 芍药苷样品HPLC图谱

图7 芍药苷空白对照HPLC图谱

图8 苦杏仁苷对照品HPLC图谱

图9 苦杏仁苷样品HPLC图谱

图10 苦杏仁苷空白对照HPLC图谱

图11 藁本内酯对照品HPLC图谱

图12 藁本内酯样品HPLC图谱

图13 藁本内酯空白对照HPLC图谱

2.5.4.2 线性关系考察 芍药苷：精密移取不同浓度的芍药苷对照品10 μl，进样量分别为1.25，2.5，5，6.25，8.75 μg，以进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程Y=934 809.43X+21 153.95，r=0.9999。

苦杏仁苷：精密移取不同浓度的苦杏仁苷对照品各10 μl，进样量分别为0.3，0.6，1.2，1.5，1.8 μg，以进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程Y=5 135 869.50X-85 728.90，r=0.9996。

藁本内酯：精密移取不同浓度的苦杏仁苷对照品各10 μl，进样量分别为0.26，0.66，1.31，2.63，3.82，3.94 μg，以进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程Y=457 219.36X-506.22，r=0.9999。

2.5.4.3 精密度试验 精密吸取2.5.2所制备的对照品溶液各10 μl，按2.5.3项下色谱条件，分别重复进样6次，记录峰面积。芍药苷、苦杏仁苷和藁本内酯峰面积值的RSD分别为1.23 %，1.11 %和0.5 %（n=6），结果表明，仪器精密度较好。

2.5.4.4 稳定性试验 精密吸取2.5.1项下供试品溶液各10 μl，分别在0，2，4，8，12和24 h进行测定，记录峰面积。得芍药苷、苦杏仁苷和藁本内酯峰面积值的RSD分别为1.48 %，1.98 %和1.58 %（n=6），结果表明，供试品溶液24 h内的稳定性较好。

2.5.4.5 重复性试验 取同一时间用同批号原料制备的贴膏，按2.5.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.5.3项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算各组分的含量，样品提取液中芍药苷、苦杏仁苷和藁本内酯的平均含量分别为0.380，0.131和0.0295 mg/ml，RSD分别为1.83 %，1.89 %和1.18 %（n=6），结果表明，方法的重复性较好。

2.5.4.6 加样回收率 取逐淤止痛灸贴0.5帖6份，剪碎，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别加入芍药苷对照品9.78 mg，苦杏仁苷对照品约3.3 mg，藁本内酯对照品约0.74 mg，按2.5.1项下方法制备6份供试品溶液，按2.5.3项下色谱条件进行测定，测得芍药苷的平均加样回收率为98.49 %，RSD=1.93 %（n=6），苦杏仁苷的平均加样回收率为97.8 %，RSD=1.29 %（n=6），藁本内酯的平均加样回收率为96.99 %，RSD=1.46 %（n=6）。结果见表1。

2.5.5 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液与3批供试品溶液各10 μl ，注入高效液相色谱仪测定，计算各批样品中芍药苷、苦杏仁苷、藁本内酯的含量，结果见表2 。

表1 芍药苷、苦杏仁苷、藁本内酯加样回收实验结果

表2 芍药苷的含量测定

3 结论

综上所述，本实验建立了逐瘀止痛远红外灸贴中牛膝、川芎、当归、桔梗和枳壳的薄层鉴别方法，方法简便易行、准确可靠；采用芍药苷、苦杏仁苷和藁本内酯多指标成分含量测定方法，使所得该膏剂的指标标准控制更加全面，专属性、重复性较好，精密度高。故本文建立的定性定量方法可作为逐瘀止痛远红外灸贴的质量标准检测方法。