复方肉苁蓉合剂质量标准的研究

祝 宇，陈 鹏，余世荣，周 灿，桂利利，余惠凡，魏 娟*

（1. 十堰市人民医院·湖北医药学院附属人民医院 药学部，湖北 十堰 442000；2. 武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000）

复方肉苁蓉合剂是由肉苁蓉、党参、丹参、甘草等8味中药制备而成的我院自制制剂，该制剂在老年病科临床使用多年，疗效确切，具有补肾填精、益气养血、活血化浊、化痰开窍的功效[1]，主要治疗肾亏气虚兼痰瘀阻络所致的轻、中度血管性痴呆症[2]。

由于复方肉苁蓉合剂质量标准的制定时间较早，只测定了其相对密度、pH，及对君药肉苁蓉进行定性鉴别，其他药味定性鉴别缺失，尤其是含量控制指标缺失，不能实现对复方肉苁蓉合剂全面有效的质控。有研究表明，毛蕊花糖苷、党参炔苷及丹酚酸B都具有改善记忆力的作用[3-5]。因此，本研究增加了复方肉苁蓉合剂中党参、丹参的薄层色谱（TLC）鉴别方法，分别新建了肉苁蓉、党参、丹参中的毛蕊花糖苷、党参炔苷及丹酚酸B含量测定方法。新的质量标准比原标准更加科学、全面，为提高和完善复方肉苁蓉合剂的质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津株式会社）；CP214十万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；Milli-QA10型超纯水系统（美国默克密理博公司）；VGT-2013QT型超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司）。

1.2 试药

方中各味药材均购于湖北神农本草中药饮片有限公司，酒苁蓉（批号20170501，产地内蒙），党参片（批号20170601，产地甘肃），丹参（批号20170301，产地湖北），蜜远志（批号20170701，产地湖北），经十堰市人民医院药检室鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部的药用标准；丹酚酸B对照品（批号：110629-201711）,丹参酮IIA对照品（批号：110766-201520，中国食品药品检定研究院）；党参炔苷对照品（批号：wkp18100801），毛蕊花糖苷对照品（批号：wkp19011509），党参对照药材（批号：ycwkq18032107），丹参对照药材（批号：140621，四川省维克奇生物科技有限公司）；复方肉苁蓉合剂（十堰市人民医院制剂中心生产，批号分别为170906，170907，170908）；缺党参药材的阴性样品、缺丹参药材的阴性样品及缺肉苁蓉药材的阴性样品均为按复方肉苁蓉合剂处方比例及工艺，除去相应药味后制得；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC色谱鉴别

2.1.1 党参TLC鉴别 取3批复方肉苁蓉合剂（批号：170906，170907，170908）各10 ml，正丁醇萃取3次，每次10 ml，合并有机层并浓缩至5 ml，作为供试品溶液。取党参对照药材1 g，加水50 ml，回流提取1 h，放冷，同法制成对照药材溶液。另取缺党参药材的阴性样品10 ml，同法制备阴性对照溶液。再取党参炔苷对照品，加甲醇制成每l ml含党参炔苷1 mg的溶液，作为对照品溶液。分别吸取上述3 批供试品溶液、阴性对照溶液各5 μl，对照药材溶液10 μl，对照品溶液3 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-甲醇（7:1:1）混合溶剂为展开剂，展开，取出，电吹风吹干，喷以10 %硫酸乙醇溶液显色，吹干，紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰[6]，见图1。

图1 复方肉苁蓉合剂中党参鉴别TLC图谱

2.1.2 丹参TLC鉴别 取批号分别为170906，170907，170908的3批复方肉苁蓉合剂各10 ml，用正丁醇萃取3次，每次10 ml，合并浓缩至5 ml，作为供试品溶液。取丹参对照药材1 g，加水50 ml，回流提取1 h，放冷，同法制成对照药材溶液。另取缺丹参药材的阴性样品10 ml，同法制备阴性对照溶液。再取丹参酮IIA对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每l ml分别含1 mg和0.5 mg的混合对照品溶液。分别吸取上述3 批供试品溶液和阴性对照溶液各5 μl，对照药材溶液3 μl，混合对照品溶液3 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6:4:8:1:4）混合溶剂为展开剂，展开，展至约离基线5 cm处取出，电吹风吹干，再以乙酸乙酯-石油醚（1:6）为展开剂再次展开，展至约离基线10 cm处，取出，电吹风吹干，喷以5 %香草醛的10 %硫酸乙醇溶液，电炉烤至斑点清晰，置于日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和混合对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且丹参阴性对照无干扰[7]，见图2。

图2 复方肉苁蓉合剂中丹参鉴别TLC图谱

2.2 毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1 %磷酸溶液（19:81）；流速：1.0 ml/min；检测波长：毛蕊花糖苷和党参炔苷检测波长分别为330，268 nm，丹酚酸B检测波长为286 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μl。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品4.13 mg、党参炔苷对照品16.38 mg及丹酚酸B对照品8.42 mg，置50 ml量瓶中，用50 %甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得（质量浓度分别为82.60，327.60，168.40 μg/ml，置于4 ℃冰箱中备用）。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取复方肉苁蓉合剂溶液10 ml，用水饱和正丁醇萃取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加50 %甲醇适量使溶解，并转移至20 ml量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 分别取缺党参药材的阴性样品、缺丹参药材的阴性样品及缺肉苁蓉阴性样品各10 ml，按2.2.3项下方法制成阴性样品溶液。

2.2.5 专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μl，按上述色谱条件测定，记录色谱图，见图3。供试品溶液的色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且阴性样品溶液在此保留时间处无干扰。

图3 复方肉苁蓉合剂中毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B含量测定HPLC图谱

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，置20 ml量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪中，按2.2.1项下色谱条件进样分析。以峰面积为纵坐标、对照品质量浓度（μg/ml）为横坐标对3种对照品进行回归分析，绘制标准曲线。结果表明，毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B分别在4.13～82.51 µg/ml、16.38～327.60 µg/ml、8.42～168.40 µg/ml范围内呈良好的线性关系, 回归方程分别为：Y=1.63×103X+4.63，r=0.9999；Y=4.39×106X-31.79，r=0.9998；Y=9.03×103X-1.67，r=0.9999。

2.2.7 精密度试验 取混合对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次，记录其峰面积，测得毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B峰面积的RSD分别为为1.61 %，1.90 %，2.28 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批次复方肉苁蓉合剂（批号：170905），按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于配制后在室温下放置0，3，6，9，12，24 h后，按2.2.1项下色谱条件进样分析，记录其峰面积，测得毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.81 %，2.15 %，1.41 %（n=6）。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取同一批次复方肉苁蓉合剂（批号：170905），按2.2.3项下方法，平行制备6份供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进行分析，记录其峰面积，测得毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B峰面积的RSD分别为2.02 %，1.90 %，1.83 %（n=6）。结果表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 分别精密称取毛蕊花糖苷对照品3.36 mg、党参炔苷对照品0.76 mg、丹酚酸B对照品4.68 mg，置100 ml量瓶中，用50 %甲醇溶解并稀释至刻度，配制成混合对照品溶液。精密量取已知含量的复方肉苁蓉合剂（批号：170905）5 ml，共6 份，分别精密加入上述混合对照品溶液各5 ml，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果得毛蕊花糖苷加样回收率为97.58 %，RSD为1.23 %（n=6）；党参炔苷加样回收率为96.94 %，RSD为2.17 %（n=6）；丹酚酸B加样回收率为97.20 %，RSD为1.44 %（n=6）。

2.2.11 样品含量测定 取3批复方肉苁蓉合剂（批号为170905，170906，170907）各3份，按2.2.3项下方法制备成供试品溶液，按2.2.1色谱条件进样分析，结果见表1。

3 讨论

3.1 定性检测药材的选择

本研究对复方肉苁蓉合剂处方中8 味中药的TLC鉴别按2015版《中国药典》和参考文献，分别开展系统性、专属性和耐用性考察研究。结果发现，党参和丹参的TLC色谱具有特征斑点，且阴性对照无干扰。远志药材中含极性相近成分，主斑点分离效果不佳；桂枝药材中桂皮醛难溶于水，供试品溶液中无与对照药材溶液相对应的斑点；枸杞子、巴戟天和甘草药材存在阴性对照干扰，故未将此5 味中药的定性鉴别纳入复方肉苁蓉合剂质量标准。

表1 复方肉苁蓉合剂的含量测定（n=3）

3.2 定量指标成分及其检测波长的选择

中药复方制剂所含化学成分极其复杂[8]，单一指标性成分并不能涵盖复方肉苁蓉合剂中全部药效的物质基础，建立多指标成分含量测定的质量评价体系，对中药复方制剂的质量控制意义重大[9]。复方肉苁蓉合剂处方中肉苁蓉质润多液，具补肾阴、肾阳之功效，为君药；党参、丹参二药合用，健脾益气养血兼活血行瘀，既可补老年气血之亏虚，又可辅佐君药填补肾精，共为臣药。因此，选择肉苁蓉、党参和丹参药材中的毛蕊花糖苷、党参炔苷和丹酚酸B作为复方肉苁蓉合剂中指标性成分。对待测成分进行全波长扫描，发现毛蕊花糖苷、党参炔苷及丹酚酸B的最大吸收波长分别为330，286，268 nm，毛蕊花糖苷和丹酚酸B最大吸收波长相差较大，单一波长检测无法使各成分均能达到较好的检测灵敏度，故采用波长切换检测法测定3指标性成分含量。

3.3 药材基原的影响

表1中3批次复方肉苁蓉合剂含量测定中发现毛蕊花糖苷和党参炔苷的含量波动相对较大，在排除工艺稳定因素外，笔者发现2015年版《中国药典》收载的肉苁蓉来源于列当科肉苁蓉和管花肉苁蓉两种植物[10]，而党参来源于桔梗科植物党参、素花党参或川党参[10]。由于药材基原不同，在性状特征、有效成分含量等方面存在差异性。因此，在拟定复方肉苁蓉合剂的含量测定质量标准时要充分考虑药材基原不同带来的影响，在药材源头确保制剂稳定的可控性。